| 研究課題/領域番号 |
24604002
|
|---|
| 研究機関 | 長崎大学 |
|---|
研究代表者 |
森石 武史 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 助教 (20380983)
|
|---|
| 研究分担者 |
小守 壽文 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (00252677)
宮崎 敏博 長崎大学, 医歯(薬)学総合研究科, 准教授 (10174161)
福田 理香 活水女子大学, 健康生活学部, 教授 (30312838)
|
|---|
| キーワード | メカニカルストレス / マイクロアレイ / 骨芽細胞 |
|---|
| 研究概要 |
マイクロアレイを用いた解析および候補遺伝子の絞り込みを以下のように行った。
(1)4ヶ月齢・雄・野生型マウスとBcl-2 tgマウスをそれぞれ『対象群』と『尾部懸垂群』に分け、尾部懸垂群は3日間の尾部懸垂を行った。実験終了後、マウスの後肢長管骨の骨端を切断し、骨髄をPBSで洗い流した後、歯間ブラシを用い、内骨膜骨芽細胞を分離した。分離した骨芽細胞および骨細胞からRNAを抽出し、マイクロアレイで発現を比較検討した。
(2)マイクロアレイの結果より、野生型マウスの対照群骨芽細胞分画vs懸垂群骨芽細胞分画で発現が2倍以上上昇した遺伝子のうち、Bcl-2 tgマウス対照群骨芽細胞分画vs懸垂群骨芽細胞分画で変化を認めない遺伝子を選択した。その結果、『細胞内に発現する遺伝子』『細胞膜に発現する遺伝子』『細胞外に発現する遺伝子』『未知の遺伝子』の中から26遺伝子に絞り込んだ。また、野生型マウスの対照群骨芽細胞分画vs懸垂群骨芽細胞分画で発現が2分の1以下に低下した遺伝子のうち、Bcl-2 tgマウス対照群骨芽細胞分画vs懸垂群骨芽細胞分画で変化を認めない遺伝子を選択した。その結果、『細胞内に発現する遺伝子』『細胞膜に発現する遺伝子』『細胞外に発現する遺伝子』『未知の遺伝子』の中から22遺伝子に絞り込んだ。
(3)現在、上記の絞り込んだ遺伝子について、プライマーを作製し、尾部懸垂を行ったマウスの骨芽細胞における発現の再現性を取っている。また、トレッド・ミル（夏目製作所 RM-5）で運動負荷をかけたサンプルでリアルタイムPCRを行い、発現を確認している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
候補遺伝子が多く、リアルタイムPCRで使用するプライマー作製に手間取ったことと、尾部懸垂実験とトレッドミル実験での発現確認のためのサンプル調製で、4ヶ月齢の野生型マウスおよびtgマウスを多数準備しなければならず、そのための時間がかかったため。
|
| 今後の研究の推進方策 |
出来るだけ早くリアルタイムPCRで変動遺伝子の確認を行いたい。再現性が認められた候補遺伝子のcDNAの一部をpBluescripts KS(-)に導入し、digoxigenin(DIG) 11-dUTPで標識したのち、T3、T7ポリメラーゼのいずれかを用いてin vitro 転写で合成し、プローブを作製する。尾部懸垂実験サンプルおよびトレッド・ミル（夏目製作所 RM-5）で運動負荷をかけた4ヶ月齢・雄・野生型マウスおよびBcl-2 tgマウスの大腿骨よりパラフィン切片を作製し、in situハイブリダイゼーションを行い、候補遺伝子の発現細胞を特定する。さらに、リアルタイムPCRで発現の再現性が得られ骨芽細胞系細胞に発現が認められた遺伝子について、培養骨芽細胞を用いた機能解析を行う。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
実験の遂行状況が少し遅れているため、試薬の購入が予定より少なかった。
以下の物品を購入する
リアルタイムPCR用の試薬、in situ ハイブリダイゼーションのプローブ作製に使用する試薬、細胞培養におけるプラスチック器具
|
