| 研究課題/領域番号 |
24620001
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(C)
|
| 研究機関 | 東北大学 |
|---|
研究代表者 |
寺西 美佳 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (10333832)
|
|---|
| 研究分担者 |
日出間 純 東北大学, 生命科学研究科, 准教授 (20250855)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| キーワード | 放射線 / 植物 / DNA / 変異 / 不安定化 |
|---|
| 研究概要 |
放射線の種類によって、誘発されるDNA損傷に特異性は見られるかに関して、線量を変えて紫外線、エックス線、イオンビームを照射したシロイヌナズナとイネの葉からDNAを抽出した。非変性条件下において電気泳動を行いDNA二本鎖切断を、アルカリ変性条件下において電気泳動を行いDNA一本鎖切断を定量した。またUVエンドヌクレアーゼを用い、シクロブタン型ピリミジン二量体（cyclobutane pyrimidine dimer: CPD）生成部位特異的にDNAを切断し、定量に用いた。またエンドヌクレアーゼIIIを用い、酸化ピリミジン生成部位特異的にDNAを切断し、定量に用いた。その結果カーボンイオンビームでは、二本鎖切断が最も多く、ついでCPD損傷、酸化損傷が生じていた。また一本鎖切断は二本鎖切断の4分の1程度の頻度で生じていた。
各種放射線の照射により生じたDNA損傷には、どの修復酵素が機能しているのかに関して、野生型シロイヌナズナと、酸化損傷修復に関与するタンパク質、またDNA鎖切断修復に関与するタンパク質の変異型シロイヌナズナを用い、イオンビームにより誘発されるDNA損傷を定量した。その結果、損傷の誘発程度はいずれの変異体も野生型と差がみられなかった。
各種放射線の照射により相同組換え頻度が上昇するのかに関して、ルシフェラーゼ遺伝子を用い、配列の一部を繰り返した形をとるプラスミド、また配列の一部を逆鎖に繰り返した形をとるプラスミドを作製した。
各種放射線照射によりゲノムの不安定化が引き起こされるのかに関して、野生型シロイヌナズナからDNAを調整し、メチル化DNA特異的抗体を用いた免疫沈降を行った。メチル化DNA特異的に切断する制限酵素を用い、得られたDNAのメチル化程度の確認を行った。また、イオンビームを照射したイネ、ならびにシロイヌナズナを生育させ、後代世代の種子を得た。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
放射線の種類によって、誘発されるDNA損傷に特異性は見られるかに関しては、シロイヌナズナを用いた定量はおおむね完了している。またイネを用いた定量は、再現性を確認している段階である。そのため、平成24年度の研究計画はおおむね達成したと言える。
各種放射線の照射により生じたDNA損傷には、どの修復酵素が機能しているのかに関しては、平成24年度の研究計画に沿って、DNA損傷の定量はほぼ終了したと言える。生育程度に関しては、繰り返し実験を行っている段階であり、おおむね達成したと言える。
各種放射線の照射により相同組換え頻度が上昇するのかに関しては、現在作製したプラスミドの配列を確認している段階であり、おおむね完成したと考えられる。今後、各種植物体にプラスミドを形質転換する予定でおり、平成24年度の計画の8割は達成したと考えられる。
各種放射線照射によりゲノムの不安定化が引き起こされるのかに関しては、得られたDNAを用いたマイクロアレイ解析を行っていないため、平成24年度の計画に対する達成度は5割程度と考えられる。しかし、放射線を照射した植物体の後代世代の種子は獲得しており、次年度の解析に用いる材料は得られたと考えられる。
以上より、全体の達成度は、おおむね順調に進展していると判断した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
放射線の種類によって、誘発されるDNA損傷に特異性は見られるかに関して、イネを用いて定量するとともに、エックス線を照射することによって生じるDNA損傷をシロイヌナズナを用いて定量する。
各種放射線の照射により生じたDNA損傷には、どの修復酵素が機能しているのかに関して、DNA修復酵素の変異型シロイヌナズナに線量を変えて放射線を照射し、その後通常条件下にて生育させ、生育阻害の程度を野生型と比較する。また、放射線照射によって誘発されたDNA損傷の修復速度を、一本鎖切断、二本鎖切断、酸化損傷、CPD損傷に分けて定量する。各種修復酵素の変異体イネを得るため、各種リソースセンターから変異体を取り寄せ、後代世代の育成を行う。
各種放射線の照射により相同組換え頻度が上昇するのかに関して、平成24年度に作製したプラスミドを用い、各種植物体にプラスミドを形質転換する。形質転換体の選抜と確認を行い、安定導入株を得る。
各種放射線照射によりゲノムの不安定化が引き起こされるのかに関して、得られたDNAを用い、DNAマイクロアレイ解析を行う。また、放射線を照射した植物体の後代世代を用い、同様の解析を行うことで、メチル化程度の変化を解析する。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
平成25年度は、各種放射線照射によりゲノムの不安定化が引き起こされるのかを解析するため、DNAマイクロアレイ解析を行う。DNAマイクロアレイは、アレイスライドが一枚あたり約10万円であり、一枚の解析に必要な消耗品が約15万円である。本年度は、平成24年度に計画していた2枚のアレイスライドを用いた解析を、平成25年度の計画に追加する形で行うことを計画している。
|
