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プリオン蛋白の重合度はプリオン病の病態形成機序と密接な関連がある。そこでプリオン感染細胞溶解液中のプリオン蛋白の重合状態を、全反射蛍光顕微鏡を用いて分子レベルで調べた。マウス神経芽腫細胞株N2aにプリオン（福岡１株）を持続感染した細胞から得た未精製の細胞溶解液を分子サイズに準じてゲルろ過スピンカラムで分画した。プリオン蛋白を検出する目的で、アミノ酸残基142-160を認識するSAF70抗体とアミノ酸残基95-110を認識する8G8 抗体の2つの抗プリオン1次抗体を用いた。SAF70抗体は正常型と異常型の両方のプリオン蛋白質を認識するが、8G8抗体が認識するエピトープは異常型では埋没していると考えられている。抗体をIgG Purification Kit-Gを用いて精製し、Fluorescein Labeling Kit-NH2を用いて蛍光ラベルした。評価方法を確立するためにサンプル調整から抗体反応、全反射蛍光顕微鏡における輝度評価までの一連の実験を繰り返し、再現性を高めた。各蛍光抗体(10 pmol) と分画したタンパク20 mg/mlとを室温で1時間反応させ、ガラス表面に吸着し、全反射蛍光顕微鏡を用いて観察した。様々な輝度の蛍光輝点が検出され、明るい輝点は8G8抗体よりも、SAF70抗体とオリゴマー分画を反応させた条件で多く見られた。この結果はプリオン蛋白オリゴマーが適切に検出され異常型プリオン蛋白分子の構造変化を観察したことを示唆している。我々はプリオン蛋白の重合度を評価する方法として、ゲル濾過スピンカラムで分画してwestern blottingで検出する方法と本研究で取組んだ蛍光色素1分子検出技術を用いてプリオン蛋白の重合度を直接観察する方法を確立した。後者は個々の分子の重合度を判定できるが、より多くの分子の重合度異常を定量的に評価できる点で前者が優れていた。
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