| 研究課題/領域番号 |
24650203
|
|---|
| 研究機関 | 分子科学研究所 |
|---|
研究代表者 |
古谷 祐詞 分子科学研究所, 生命・錯体分子科学研究領域, 准教授 (80432285)
|
|---|
| 研究分担者 |
中條 浩一 生理学研究所, 分子生理研究系, 助教 (80390699)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
|
| キーワード | 赤外分光法 / イオンチャネル / 生物物理学 / 分子科学 / 振動分光法 |
|---|
| 研究概要 |
本研究は主に以下の２つの研究項目からなる。（１）哺乳動物イオンチャネルの蛋白質発現系構築、（２）全反射赤外差分光計測によるイオン結合誘起赤外差スペクトル計測
平成２４年度は哺乳動物由来のイオンチャネルの全反射赤外分光法によるイオン－タンパク質間相互作用の解析を目指して、哺乳培養細胞でのイオンチャネル蛋白質の試料調製を試みた。様々なカリウムチャネルとGFPとの融合タンパク質のコンストラクトを作成し、ゲル濾過クロマトグラフィーと蛍光検出を組みあせたFSEC解析を行った。その結果、いくつかのコンストラクトで良好な結果が得られた。
FSEC解析の結果、機能的な発現が良好と認められるカリウムチャネルに対して、Hisタグを結合したコンストラクトを作成し、タンパク質の大量発現を行った。界面活性剤で抽出した後に、リン脂質と混合し、透析を行うことでリポソームに再構成した。このような試料に対して、全反射赤外分光解析を行い、２種類の緩衝液（一方はカリウムイオンのみを含む、他方はナトリウムイオンのみを含む）存在下で計測した赤外吸収スペクトルの差分を解析した。その結果、細菌由来のカリウムチャネルであるKcsAと似た赤外差スペクトルが確認できた。カリウムチャネルに特徴的なイオン選択フィルターに由来するシグナルであるものと推察される。
また、前述のKcsAの赤外分光解析の結果については論文発表を行った（Y. Furutani et al., J. Phys. Chem. Lett. 3, 3806-10, 2012）
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
哺乳動物由来のカリウムイオンチャネルのタンパク質発現と精製に成功した。さらに、予備的ではあるがイオン結合誘起赤外差スペクトル計測にも成功している。
|
| 今後の研究の推進方策 |
良好な結果が得られているカリウムイオンチャネルに対して、さらに赤外分光解析を進める。様々なカリウムイオン濃度での計測を行うことで、タンパク質－イオン間の相互作用の強さを解離定数から議論する。また、変異体を作成し、得られた信号の帰属を試みる。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
カリウムチャネルのタンパク質試料調製用の試薬やガラス器具等の消耗品の購入に充てる。また、分担者の中條は電気生理実験や蛍光観察実験などに必要となる試薬や光学部品などの購入に充てる。
|
