重油汚染海水で生まれた魚の脊柱彎曲の機構解明と新規解毒タンパク質によるレスキュー

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24651044
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 早川 和一 金沢大学, 薬学系, 教授 (40115267)
• 研究分担者: 鈴木 信雄 金沢大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (60242476) ; 大嶋 雄治 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (70176874)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: 有害化学物質 / 海洋生態 / 環境分析 / 水産学

研究概要

① PAHおよびその水酸化体としてBenz[a]anthracene（BaA）と4-Hydroxybenz[a]anthracene (4-OHBaA)を用いて、メダカの胚発生の影響を評価した。その結果、BaAあるいは4-OHBaAをメダカ胚に投与すると、投与後1日目に多くの胚で発生停止が見られ、LC50はBaAで0.12nM、4-OHBaAで0.027 nMであり、PAH類は胚発生初期に対する影響が大きいことが示された。さらに親化合物（BaA）は水酸化されるとその毒性が4.4倍強まることがわかった。
② BaAをキンギョの腹腔内に投与（5μg／g B W）し、12、24、48及び72時間後に胆汁を採取して、胆汁を分析した。なお、採取した胆汁中のPAH類はグルクロン酸抱体あるいは硫酸抱合体として存在しており、それぞれに対応する酵素で加水分解した後、HPLC による分離が可能となる。そこで1-Hydroxypyreneグルクロニドをβ-グルクロニダーゼ・アリルスルファターゼを用いて分解して、その回収率を求めた。回収率は、2 時間インキュベーションしたものが、最も高い回収率（67.34 %）であったので、このタイムコースで胆汁を分析した。その結果、胆汁中に4-OHBaA が検出され、12から48 時間と時間の経過に伴って濃度が上昇し、72 時間では少し低下した。
③ 魚ウロコの評価システムを用いて4-OHBaAの骨芽細胞及び破骨細胞に対する作用を解析した結果、4-OHBaAは 6 時間で骨芽細胞、破骨細胞ともに活性が上昇し、破骨細胞では0.1 nMの濃度まで変化を感知することができた。一方 4-OHBaA の親化合物であるBaAは6 時間より遅れて、12 時間で破骨細胞活性の上昇が起こった。したがって、BaAが魚のウロコの中で代謝され、水酸化体となり、毒性を示している可能性が高い。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成24年度は、①魚の初期発生に対するPAHの影響、②魚類のPAHの代謝産物測定のための評価系の開発、③魚ウロコのPAHの骨芽細胞及び破骨細胞に対する影響評価に関する実験を計画して交付申請書に記載した。これらの実験は順調に進行して、研究実績の項目に記載した。メダカの胚においても、代謝産物である水酸化体の毒性が親化合物の毒性よりも高く、ウロコのアッセイにおいても魚の骨代謝を攪乱していることが判明した。さらに実際に魚にPAHを投与すると、魚類の胆汁から水酸化PAH（4-Hydroxybenz[a]anthracene：4-OHBaA）を検出することに成功した。したがって、本研究において、魚に投与したPAHはP450により代謝されて、水酸化PAHになり、その水酸化体が魚に毒性を示していることが証明されたといえる。

今後の研究の推進方策

昨年度は、in vitroの魚ウロコの評価システムを用いて4-OHBaAが破骨細胞及び骨芽細胞の活性を上昇させた。そこで本年度は、in vivoに注目して実験を行うと共に、in vitroで4-OHBaAのウロコに対する作用を遺伝子レベルで解析する。
さらに解毒タンパク質とPAHの代謝産物（PAH）との結合実験を行い、PAHのレスキューが解毒タンパク質により行えるかを解析する。以下に詳細に示す。
魚のウロコに関する実験：日本海重油汚染事故に伴う海洋中のBaP濃度が約0.01 nMであったこと、またアイナメの可食組織のBaP濃度が0.13 ng/gであったこと（Hayakawa et al., 2006）を参考として、キンギョの体内濃度が0.1 ng/g body weight（BW）となるようにBaAを投与して、ウロコの再生（骨形成）に対する作用を調べる。さらに、in vitroで魚のウロコを培養して、培養後、ウロコからRNAを抽出して、リアルタイムPCRにより、骨特異的マーカー遺伝子の発現を解析する。
解毒タンパク質との結合実験：解毒タンパク質とPAHの代謝産物（OHPAH）との結合実験を行う。既に得られている解毒タンパク質の遺伝子組換え体(rTBT-bp1, rTBT-bp2)を用いて、OHPAHとの結合試験を行う。解毒タンパク質(TBT-bp1, TBT-bp2)組換え体溶液に対し、蛍光プローブを加えた後、OHPAH溶液を滴下して蛍光プローブを脱着させ、蛍光強度の変化を測定して、OHPAHの結合性を測定する。

次年度の研究費の使用計画

本研究で使用する手法は全て開発済であり、購入すべき備品もない。そこで、開発した方法に使用するキットや消耗品を中心に購入して研究を遂行していく予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Polychlorinated biphenyl (118) activates osteoclasts and induces bone resorption in goldfish (2014)
  • 著者名/発表者名: Yachiguchi, K., Matsumoto, N., Haga, Y., Suzuki, M., Matsumura, C., Tsurukawa, M., Okuno, T., Nakano, T., Kawabe, K., Kitamura, K., Toriba, A., Hayakawa, K., Chowdhury, V.S., Endo, M., Chiba, A., Sekiguchi, T., Nakano, M., Tabuchi, Y., Kondo, T., Wada, S., Mishima, H., Hattori, A., Suzuki, N.
  • 雑誌名: Env. Sci. Poll. Res. 巻: 21 (10) ページ: 6365-6372
  • DOI: 10.1007/s11356-012-1347-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] Static and dynamic hypergravity responses of osteoblasts and osteoclasts in medaka scales (2013)
  • 著者名/発表者名: Yano, S., Kitamura, K., Satoh, Y., Nakano, M., Hattori, A., Sekiguchi, T., Ikegame, M., Nakashima, H., Omori, K., Hayakawa, K., Chiba, A., Sasayama, Y., Ejiri, S., Mikuni-Takagaki, Y., Mishima, H., Funahashi, H., Sakamoto, T., Suzuki, N.
  • 雑誌名: Zoological Sci. 巻: 30 (3) ページ: 217-223
  • DOI: 10.2108/zsj.30.217
  • 査読あり
• [雑誌論文] Determination of calcium sensing receptor in the scales of goldfish and induction of its mRNA expression by acceleration loading (2012)
  • 著者名/発表者名: Kakikawa, M., Yamamoto, T., Chowdhury, V. S., Satoh, Y., Kitamura, K., Sekiguchi, T., Funahashi, H., Omori, K., Endo, M., Yano, S., Yamada, S., Hayakawa, K., Chiba, A., Srivastav, A. K., Ijiri, K., Seki, A., Hattori, A., Suzuki, N.
  • 雑誌名: Biol. Sci. Space 巻: 26 ページ: 26-31
  • DOI: 10.2187/bss.26.26
  • 査読あり
• [雑誌論文] Analysis of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in human urine using hydrophilic interaction chromatography with tandem mass spectrometry (2012)
  • 著者名/発表者名: Hosozumi, C., Toriba, A., Chuesaard, T., Kameda, T., Tang, N., Hayakawa, K.
  • 雑誌名: J. Chromatography B 巻: 893-894 ページ: 173-176
  • DOI: 10.1016/j.jchromb.2012.02.043
  • 査読あり
• [雑誌論文] 魚類のウロコを用いた評価系の開発と骨代謝研究への応用 (2012)
  • 著者名/発表者名: 鈴木 信雄
  • 雑誌名: まぐね 巻: 7 ページ: 174-178
  • 査読あり
• [雑誌論文] Prostaglandin E2 increases both osteoblastic and osteoclastic activity in the scales and participates in calcium metabolism in goldfish (2012)
  • 著者名/発表者名: Omori, K.
  • 雑誌名: Zoological Science 巻: 29 ページ: 499-504
  • DOI: 10.2108/zsj.29.499
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cloning of two members of the calcitonin-family receptors from stingray, Dasyatis akajei: Possible physiological roles of the calcitonin family in osmoregulation (2012)
  • 著者名/発表者名: Suzuki, N.
  • 雑誌名: Gene 巻: 499 ページ: 326-331
  • DOI: 10.1016/j.gene.2012.03.042
  • 査読あり
• [学会発表] キンギョの再生ウロコにおける隆起線形成リズム (2012)
  • 著者名/発表者名: 黒田 美翔
  • 学会等名: 第37回日本比較内分泌学会大会
  • 発表場所: 福井大学（福井県）
  • 年月日: 20121129-20121201
• [学会発表] Polychlorinated biphenyl disrupts bone metabolism in goldfish (2012)
  • 著者名/発表者名: Yachiguchi Koji
  • 学会等名: 7th International PCB Workshop
  • 発表場所: Palais des Congrès of Arcachon(France)
  • 年月日: 20120527-20120531