| 研究課題/領域番号 |
24651046
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
古谷 寛治 京都大学, 放射線生物研究センター, 講師 (90455204)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 蛍光タンパク質 / チェックポイント / リン酸化 / DNA損傷 |
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| 研究概要 |
本研究においてはDNA損傷応答を視覚化するためのプローブ作製を目的とした。近年のDNA損傷応答研究の進歩は顕微鏡の技術向上と蛍光プローブの開発に負うところが大きい。ライブイメージングによるタンパク質の局在からDNA損傷部位への各因子の集積をモニターしたり、それに関わる因子の獲得からDNA損傷応答のダイナミックな制御が明らかとなった。一方でそれらの因子の挙動が実際に活性化したDNA損傷応答タンパク質か、という疑問に関しては答えられていない。
申請者らはこれまでにDNA損傷応答の司令官役というべきチェックポイント機構がリン酸化により幾つかのタンパク質間相互作用を引き起こす事を見出して来た。本研究ではそれらのうちRad9タンパク質とCut5タンパク質のリン酸化依存的な結合を利用したプローブの作製を試みた。DNA損傷を受けた細胞内ではRad9タンパク質がリン酸化を受け、Cut5タンパク質と結合する。この結合をBiFcと呼ばれる手法を用いてライブイメージングでの視覚化が可能となる。具体的には蛍光タンパク質のカルボキシル末端部をRad9タンパク質に、アミノ末端部をCut5タンパク質に付加させ細胞内で共発現させた。これらはDNA損傷を受けた細胞内では会合し、即ち分割された蛍光タンパク質も会合する。実際にDNA損傷を受けた細胞ではこれら共発現したプローブが弱いながらも蛍光をより強く発するのが確認出来た。
このプローブはチェックポイントの上流に位置するATRキナーゼの基質を用いており、即ち、細胞内でのATRキナーゼ活性の動態をモニター出来ていると思われる。現在は下流のキナーゼの活性をモニターするプローブ作製も並行して行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の目的の蛍光プローブは作製完了したが、プローブの感度は期待よりも良くはなかった。DNA損傷応答が内細胞においてもシグナルが検出された。DNA損傷を受けた細胞では有為にシグナルが増強されたが、実際に生体内で使用出来るかは未知である。これまでの結果は分裂酵母細胞における結果であり、現在はヒト培養細胞に導入しているところである。一方で、外部からDNA損傷を加えない細胞に置いても検出された、という事は普段からこの経路はスイッチが入っている事を示唆している。現在はリン酸化抗体等でリン酸化ステータスを検出中である。また、別のタンパク質間相互作用をプローブに用いる事を検討している。チェックポイント経路の下流に位置するChk2キナーゼの基質である。このキナーゼの活性はDNA損傷応答の前と後で100倍程度変化する。既にコンストラクションは完成しており、分裂酵母細胞に導入している最中である。当初予定していたプローブ作製は未だ実用化までは至っていないが、第二のプローブ作製が順調に行えているので（２）の査定を下した。
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| 今後の研究の推進方策 |
既に作製した蛍光プローブ（ATRキナーゼ）を実際に高等生物細胞に導入する。安定に一定コピーの発現を保つ株をスクリーンし、蛍光の分布を観察する。もう一方の蛍光プローブ、Chk2用のプローブは先ず、分裂酵母内で発現を行い、その挙動を観察する。タンパク質の発現をモニターしながらDNA損傷の有無でシグナル強度がどのように変化するかをモニターする。Chk2キナーゼは全てのDNA損傷において発動する訳ではない。DNA複製時の損傷のみに応答するため細胞に与えるDNA損傷を色々と変えながら検討する。酵母細胞で検討した後に高等生物細胞へ導入を試み、挙動を観察する。第二のプローブもまた、リン酸化基質を用いたプローブである。リン酸化を検出可能とする抗体の作製も検討しつつ進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
端数がでたために５００円強の余剰金がでた。消耗品等に使用する予定である。
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