| 研究課題/領域番号 |
24651214
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
田嶋 正二 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (50132931)
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| 研究分担者 |
木村 博信 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教 (60378891)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 生物工学 / DNAメチル化 / DNAメチル化酵素 |
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| 研究概要 |
本計画では、全く新規メチル化活性をもたず、ヘミメチル化DNAだけをメチル化する変異型の維持DNAメチル化酵素Dnmt1を用いることにより、メチル化状態を保持したままゲノムを増幅する技術と、それを基にして、ヒドロキシル化修飾を受けたメチル化部位を一塩基レベルで解析する技術を開発するものである。この技術を適用することにより、これまで解析が困難であった微量生体DNA資料を、メチル化状態を保持したまま増幅し、解析することが可能になる。また、Dnmt1がヘミ・ヒドロキシメチル化DNAをメチル化できないことを利用して、バイサルファイト・シーケンシング法と組み合わせて、ヒドロキシメチルシトシンの一塩基レベルでの配列決定法を開発する。
今年度は、ヘミメチル化DNAを用いることにより、変異型組換えDnmt1が野生型の組換え酵素に比べて格段に新規メチル化活性が低いことをバイサルファイト法により確認した。また、ヘミ・ヒドロキシメチル化部位には、野生型、変異型組換えDnmt1ともほとんどメチル化することができなかった。これらの結果は我々が作成した変異型組換えDnmt1を用いることにより、ゲノムの特定の領域のヒドロキシメチル化部位を一塩基レベルで解析できる可能性を示すことができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
変異型の組換えDnmt1がヘミメチル化DNAを忠実にメチル化する性質をもつこと、さらに、野生型と同様ヘミ・ヒドロキシメチル化DNAをメチル化できないことを確認できた。申請計画を変更し、増幅を繰り返さない方法により検証を行った。この変異型組換え体は結晶ができる純度と量が得られるように改良できたことは、技術の確立をはかるうえで有利となる。
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| 今後の研究の推進方策 |
検証に用いるDNAの配列に天然の配列を選び、さらに変異型の組換えDnmt1のヘミメチル化、ヘミ・ヒドロキシメチル化DNAのメチル化活性の性状をさらに検証する。また、別のプロジェクトによりゲノムのヒドロキシメチル化が高度に付加されている領域を同定しているので、これら領域について変異型組換えDnmt1を用いてヒドロキシメチル化シトシンの位置を同定できるのか検証する。具体的には、検証する特定のゲノム領域に相補する一方向のプライマーでヘミ・ヒドロキシメチル化を排除したヘミメチル化DNAを合成し、これをバイサルファイト法によりメチル化位置を解析し、親鎖のメチル化状態の解析と比較することによりヒドロキシメチル化位置を同定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
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