2012 年度実施状況報告書

核酸修飾酵素を用いた新規原理によるＲＮＡ結合タンパク質ターゲットの網羅的同定

研究課題

研究課題/領域番号	24651215
研究種目	挑戦的萌芽研究
研究機関	大阪大学
研究代表者	熊谷雄太郎大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (00528408)
研究期間 (年度)	2012-04-01 – 2014-03-31
キーワード	RNA結合タンパク質
研究概要	本研究は核酸修飾酵素を用い、それとRNA結合タンパク質の融合タンパク質を作製、発現させることにより、RNA結合タンパク質のターゲットを網羅的に同定することを目指したものである。本年度は核酸を修飾する酵素のスクリーニングと反応条件の最適化を行った。まず、RNA結合タンパク質としてMS2 capsid proteinを用いて各酵素との融合タンパク質発現系を作製した。また、そのターゲットとしてMS2 stem loopを持ったルシフェラーゼ遺伝子を作製し、これらをHEK293細胞に導入、修飾の有無をbisulfite sequencingによって確認する、酵素と反応条件を最適化するコントロール実験系を確立した。大腸菌由来のRNA修飾酵素を用いて予備実験を行った結果、最適なbisulfite反応条件を確立した。一方、酵素による修飾の効率が最適でないとの結論に至った。そこで、種々の細胞由来のRNA修飾酵素を用いてスクリーニングを行なった。一方、次世代シーケンサを用いた網羅的同定には、修飾を受けたRNAを識別するアルゴリズムが必要となる。本年度はCLIP-seqなどに使われているアルゴリズムを検討し、人工的に作製したデータ群を用いて、その応用を試みた。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由使用する酵素のおよびbisulfite反応条件の最適化を行うコントロール実験系を確立することが出来、bisulfite反応の最適化に成功した。また、使用する酵素を選択する段階に入っているが、未だ実際に興味あるRNA結合タンパク質を用い、次世代シーケンサを用いた大規模な実験を行うのは尚早である段階に留まっている。
今後の研究の推進方策	引き続きコントロール実験系を用いて、修飾効率のよいRNA修飾酵素の選定を行う。選定された酵素を用い、HuR, Zfp36, Regnase-1などのRNA結合タンパク質との融合タンパク質発現系を構築し、HeLa細胞、RAW細胞などの細胞株に導入する。全RNAを調製後、次世代シーケンサを用いてbisulfite sequencingを行い、修飾されているRNA、すなわちRNA結合タンパク質のターゲットと、修飾されていないRNAとを区別し、ターゲットを同定する。また、前年度に引き続き、修飾されているRNAを区別するアルゴリズムを実装する。
次年度の研究費の使用計画	次年度においては最適な酵素を選択した後、HuR, Zfp36, Regnase-1などのRNA結合タンパク質を対象として本研究の原理を適用するため、次世代シーケンサをもちいたRNA配列決定を行う予定である。そのための費用と、細胞培養、および遺伝子発現系構築のための試薬に関わる費用を計上している。