| 研究実績の概要 |
本研究は核酸修飾酵素を用い、それとRNA結合タンパク質の融合タンパク質を作製、発現させることにより、RNA結合タンパク質のターゲットを網羅的に同定することを目指したものである。
本年度は前年度に引き続き反応条件の最適化等を試みた。まず、前年度のRNA修飾酵素の発現がマウス胚性繊維芽細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)では起こらないという結果を受けて、遺伝子導入方法の検討とコドン最適化などを試みた。MEFにおいてリポフェクション法、エレクトロポレーション法、レトロウイルスを用いた導入を試み、Western blottingによりタンパク質の発現を確認したが、発現が見られなかった。そこで、大腸菌由来のRNA修飾酵素に対してコドン最適化を行い、再びRNA結合タンパク質としてMS2 capsid proteinを用いて酵素との融合タンパク質発現系を作製した。MS2 stem loopを持ったルシフェラーゼ遺伝子とともにMEF細胞に導入、RNA修飾の有無をbisulfite sequencingによって確認した。しかしながら、いずれの酵素においても発現が見られない、または修飾が十分でなかった。
そこで修飾酵素の探索範囲を拡大し、HEK293細胞でのコントロール実験系を用いて至適な酵素を探しつつ、当初計画を修正し、HEK293細胞における過剰発現系においては少なくともMS2を用いたポジティブコントロールは機能するという結果に基づき、HEK293細胞においてRNA結合タンパク質のターゲット遺伝子同定を試み、継続して研究を行うこととした。
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