低酸素応答性発光プローブ イリジウム錯体によるミトコンドリア呼吸鎖機能の解析

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24651256
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 竹内 利行 群馬大学, 特任教授 (00109977)
• キーワード: バイオテクノロジー / 生体機能利用

研究概要

生体で消費される主要エネルギーは、ミトコンドリア呼吸鎖の電子伝達系で電子が４つの複合体をリレーする過程で内外膜間隙にプロトンが貯えられ、そのプロトンのドライブによってATPとして産生される。この電子リレーでO2が消費されるが、0.1-2%は電子対にならず、反応性に富む活性酸素（ROS）となる。従って、激しい運動などで多量の酸素を消費すると多量のROSを生ずる。ところで、ROSはその基となる酸素が十分にある状態よりも低酸素状態時の方が多量に発生する。そこで、「ミトコンドリアでROSは酸素消費に応じて発生するはずだが、低酸素状態でROS発生が増加するのはなぜか」と云う問いを立てた。
我々はこれまで赤色発光イリジウム錯体Ir(btp)2(acac) [BTP]（分子量 712）を基本型として用いてきた。BTPは光学特性に関わる２つの主配位子と、光学特性には関わらず、水や脂質の親和性を変える補助配位子acetylacetone（acac）からなる。BTPは脂溶性で細胞内では小胞体 (ER) に局在する。24年度は、BTPをミトコンドリアに局在させるために、acacにミトコンドリア指向性triphenyl phostin (TPP) をつけ、ミトコンドリア局在性をもつ誘導体BTP-TPPを合成した。25年度は本BTP-TPPを用い、ミトコンドリアの多い細胞と少ない細胞で比較するとミトコンドリア数と比例して発光した。次に、ラット心筋培養細胞を用い、心筋拍動をβアゴニスト10 μM isoproterenol、100 μM carbachol で増加させ、更にβブロッカー propanolを加えてβアゴニストの作用を抑えた。発光はβアゴニスト添加と共に増加し、βブロッカーで抑制された。つまり、心筋細胞の拍動増加とともに低酸素状態が加速し、βブロッカーでそれは緩和した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

２５年度に、通常のBTPを用いて細胞内が低酸素状態になるためにはミトコンドリアが十分に機能することが重要で、分化機能を維持した前立腺癌細胞と低分化状態の前立腺癌細胞を用い、ミトコンドリアの電子伝達系ブロッカー（ロテノン）や、ミトコンドリアDNA欠損細胞では十分な低酸素状態とならないことを示した（研究発表：PLoS ONE）。さらに、ミトコンドリア指向性 BTP-TPPで、その発光はβアゴニスト添加と共に増加し、βブロッカーで抑制されることを示した。これによって更に詳細なミトコンドリア機能と低酸素状態発生メカニズムを研究する基盤が確立された。

今後の研究の推進方策

グルコース応答性を保つマウス膵β細胞株MIN6と、波打つ収縮・弛緩を観察できるラット心筋初代培養細胞を用いる。共にミトコンドリアに富む細胞で、本研究に適していると判断した。MIN6は我々の研究室で常時用いている細胞で、低グルコース、低酸素、サイトカイン刺激で大量のROS発生を観察できる (Endocrinology 151: 4705, 2010)。ROS検出はそれを安定的に検出できる蛍光プローブ（PF-TMROS）を用いる。ROS検出で頻用されている5-(and-6-)-chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate (CM-H2DCFDA)は不安定で、測定値が変動しやすいので用いない。SenSysTM charge付きLSM5 PASCALコンフォーカル顕微鏡（Carl Zeiss）で定量して数値化する。ミトコンドリアの同定にはMitoTrackerを用いる。
心筋初代培養は、以前心筋肥大の実験で用いたことがあり（JBC 272: 20545, 1997）、心筋細胞の機能不全状態である心筋肥大技術ももっている。

研究成果

• [雑誌論文] Mitochondrial respiratory function induces endogenous hypoxia. (2014)
  • 著者名/発表者名: Priora S, Kim A, Yoshihara T, Tobita S, Takeuchi T, Higuchi M.
  • 雑誌名: PLoS ONE 巻: 9 ページ: e88911
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0088911
  • 査読あり / オープンアクセス / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Silylation improves photodynamic activity of tetraphenylporphyrin derivative in vitro and in vivo. (2014)
  • 著者名/発表者名: Horiuch H, Hosaka M, Mashio H,Ishida S, Kyushin S, Okutsu T, Takeuchi T, Hiratsuka H.
  • 雑誌名: Chemistry - A European J 巻: 20 ページ: 1-8
  • DOI: 10.1002/chem.201303120.
  • 査読あり
• [学会発表] 低酸素組織の光イメージングを目指したジピリナート類を配位子に有する近赤外りん光イリジウム錯体の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 吉原利忠、八木橋美樹、田中亜沙美、寺田幹、穂坂正博、竹内利行、飛田成史
  • 学会等名: 第８回日本分子イメージング学会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 20130530-20130531
  • 招待講演
• [図書] Synthesis of novel silylated pyrene units and theira application as a functional labeling agent for bioactive components such as oligoDNA and cholesterol, In Pyrene: Chemical Properties, Biochemistry Applications and Toxic Effects. (2013)
  • 著者名/発表者名: Shinozuka K, Takeuchi T.
  • 総ページ数: 23
  • 出版者: Nova Scientific Publishers, Inc. NY, USA