| 研究課題/領域番号 |
24651261
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
竹内 俊文 神戸大学, 工学(系)研究科(研究院), 教授 (70179612)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 分子認識 / 分子インプリンティング / タンパク質 / 生体分子計測 |
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| 研究概要 |
本研究では分子インプリンティングとポストインプリンティング修飾を組合せた新しいタンパク質認識材料合成法により、標的タンパク質認識空間のみに結合情報レポーター分子を配置した低バックグランド蛍光センシング材料を基板上にパターン合成し、これまでにない高選択性蛍光検出機能が埋め込まれた人工プロテインチップを構築することを目的とする。高い分子認識能を有するインプリント材料を得るためにはより正確なタンパク質の鋳型をとることが必要である。そのために鋳型タンパク質を基板上に固定化し、タンパク質自身の分子運動を抑制した状態でインプリンティングを行うことでそれらの課題を克服する。
本年度はカルボキシル基末端をもつタンパク質固定化用リンカー分子の設計および合成にまず着手した。Cystamine dihydrochlorideを出発物質とし、まず片方のアミノ基をdi-tert-butyl dicarbonateを用いて保護し、もう片方のアミノ基をdiglycolic anhydrideと反応させることによりカルボキシ基の導入を行った。HCl/Dioxaneにて保護基の除去を行った後、3-isocyanatopropyltriethoxysilaneと反応させることにより、カルボキシ基を有するリンカー分子を得た(トータル収率8.13 %)。
また、カルボキシ基またはマレイミド基のリンカー部分をもつ類似化合物は、鋳型タンパク質であるヒト血清アルブミン、チトクロームcと相互作用させた時、タンパク質の2次構造に大きく影響を与えないことを円二色性スペクトルの測定から確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
カルボキシ基末端を有するリンカーに関してその合成に成功している。このリンカーはタンパク質固定化のための官能基(本年度はカルボキシ基)とガラス基板への修飾にためにシランカップリング可能な官能基(トリエトキシシラン)、そしてインプリントポリマー作製後の鋳型タンパク質を除去しやすいようにジスルフィド結合を有している。還元処理による鋳型タンパク質除去後に残るチオール基に適切な蛍光分子を導入することにより、タンパク質結合空間のみに蛍光レポーター分子を独占的に導入した蛍光センシング材料が得られると考えられることから本リンカーの合成は非常に重要である。
現在、合成したリンカー分子の基板への固定化及び標的タンパク質の基板へのリンカーを介した固定化に関して検討を行っている。また、他のリンカー分子に関しても、現在合成中であり、基本手順はどのリンカーに関しても同様であり問題は特にないと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
残りのリンカーについて合成を進める。合成したリンカー分子を用いた各種タンパク質固定化条件の検討及び分子インプリンティング条件の検討を行い、ガラス基板上にインプリントポリマーアレイを作製する。インプリンティングの際に用いる機能性モノマーは、塩基性タンパク質に対してはアクリル酸、酸性タンパク質に対してはジアミノエチルアクリレートを用いる。架橋剤には親水性のメチレンビスアクリルアミドを用いる。架橋剤比率を変化させて、架橋度と分子認識能およびタンパク質の除去率を指標に架橋度と膜厚の最適化を行う。鋳型タンパク質は、トリスカルボキシエチルホスフィン処理してジスルフィド結合を解裂させた後、１M NaClおよびTween 20で洗浄することでの除去する。洗浄後の基板に各種チオール反応性蛍光物質を導入して、タンパク質の結合情報を最も感度よく読みだすことの出来る蛍光物質を選択する。得られたインプリントポリマーアレイ基板の感度・選択性に関して蛍光測定の結果から詳細に検討を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度使用額727,750円は、以下のようにリンカー合成用試薬、モノマー、ガラス器具などの消耗品に充てる。リンカー分子の合成のために必要な合成試薬、鋳型タンパク質、インプリントポリマー合成用の試薬(モノマー、架橋剤)、各種蛍光物質、溶媒、窒素ガス及びガラス器具等購入のための物品費として627,750円を計上している。本申請では研究分担者を置いていないので、資料収集や整理のために研究補助は、研究を迅速かつ効率的に遂行するために必要であり、これに充てる。人件費の積算は1000円/時間を想定しており、1日4時間・25日分の予算100,000を計上している。
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