| 研究概要 |
本研究では大腸菌体内で構成された蛋白質-tRNA複合体を用いて，目的の成熟tRNAを簡便かつ高純度に調製する系を構築する事を目指す．
平成24年度までに，複数種の蛋白質-tRNA複合体が得られていたが，平成25年度は，セレン導入蛋白質とtRNAの複合体に注目し，その解析を目指した．この蛋白質はtRNA(Gln)，tRNA(Glu)，tRNA(Lys)を基質とするため，これらの共発現系を構築した．tRNAの発現ベクターにはpET22b，蛋白質の発現にはpCOLAを用いた．大腸菌中で形成した複合体を精製し，Urea PAGEにより解析した結果，非常に高純度のtRNAが得られた．詳細についての知見を得るために，蛋白質-tRNA複合体の結晶化を行ったところ，PEG3350を含む条件下で結晶が得られた．クライオプロテクタントの添加などの結晶化条件の最適化の末，4Åの分解能のX線回折データを収集する事に成功した．格子定数はa=90, b=104, c=130 alpha=90, beta=108, gamma=90である事がわかった．分子置換法による構造解析を試みたが，有意な解は得られなかった．解析に向け，今後，良質な結晶を得る必要がある．
期間全体を通し，TmcA(K205A)変異体を用いたtRNA(Met)の調製系，およびセレン導入蛋白質を用いたtRNA(Gln)，tRNA(Glu)，tRNA(Lys)の調製系を構築した．これらのRNAはいずれも，Niアフィニティクロマトグラフィーを用いて大腸菌破砕液から簡便に得る事ができ，本研究の有用性が示された．さらに，生体内から得られたこれらの成熟tRNAの詳細な解析に向け，各々のtRNAの結晶化および初期X線回折データの収集を行った．構造解析には至らなかったが，結晶学的パラメータを決定する事ができた．詳細な構造解析に向け，今後は，これらの結晶の改良を進める必要がある．
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