細胞検査用高機能バイオチップの創製

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24656500
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 三原 久和 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (30183966)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: バイオチップ / ペプチド / 細胞

研究概要

細胞と種々の異なる相互作用をするペプチドリガンド群を搭載した細胞検査バイオチップを創製することを目標とする挑戦的萌芽研究を計画的に行った。平成24年度は、予備的に見出している細胞の種類により大きく異なる細胞挿入活性を有するペプチドをさらに種々デザインし、より多様な活性をもつペプチドリガンド群を創出した。また、これらペプチド群の細胞相互作用メカニズムを調べることは、より良いペプチドデザインや細胞検査バイオチップ応用に不可欠であり、ペプチドと細胞表面受容体との相互作用を解析する研究を開始した。１．細胞挿入活性を有するペプチドリガンドのデザインと合成：Tatなどの天然ウイルス由来ペプチドや人工のオリゴアルギニンペプチドなど多くの細胞挿入活性ペプチドが知られている。本研究では、系統的アミノ酸置換が行えるよう設計した両親媒性のαへリックスペプチド群をデザインし、合成した。２．ペプチドリガンドの細胞挿入活性：設計合成したペプチドリガンドの細胞挿入活性を、ペプチドに導入する蛍光基や金ナノ粒子により評価した。ペプチドのアミノ酸配列の違いにより、どのように細胞挿入活性に違いが出るかを詳細に検討し、細胞検査に適合したペプチド群を4種選定した。とくに配列中央にAlaあるいはPheをもつペプチドでは細胞への挿入活性や細胞腫への特異性が大きく異なることを見出した。３．細胞挿入活性ペプチドの相互作用メカニズム評価：ペプチドの細胞挿入活性に関する細胞相互作用メカニズムの解析は、ペプチド群を細胞検査チップ応用するための重要な知見となる。ペプチド濃度、相互作用時間など種々の条件を変えたペプチドの細胞挿入活性分析を行った。また、細胞表層の相互作用標的候補となる硫酸化多糖類とペプチドとの相互作用を評価する研究を開始した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

細胞と種々の異なる相互作用をするペプチドリガンド群を搭載した細胞検査バイオチップを創製することを目標とする挑戦的萌芽研究を計画的に行うことができた。平成24年度は、予備的に見出している細胞の種類により大きく異なる細胞挿入活性を有するペプチドをさらに種々デザインし、より多様な活性をもつペプチドリガンド群の創出に成功した。また、これらペプチド群の細胞相互作用メカニズムを調べることは、より良いペプチドデザインや細胞検査バイオチップ応用に不可欠であり、ペプチドと細胞表面受容体との相互作用を解析する研究を開始できた。１．細胞挿入活性を有するペプチドリガンドのデザインと合成：本研究では、系統的アミノ酸置換が行えるよう設計した両親媒性のαへリックスペプチド群をデザインし、合成できた。２．ペプチドリガンドの細胞挿入活性：設計合成したペプチドリガンドの細胞挿入活性を、ペプチドに導入する蛍光基や金ナノ粒子により評価できた。ペプチドのアミノ酸配列の違いにより、どのように細胞挿入活性に違いが出るかを詳細に検討し、細胞検査に適合したペプチド群を4種選定し、とくに配列中央にAlaあるいはPheをもつペプチドでは細胞への挿入活性や細胞腫への特異性が大きく異なることを見出した。３．細胞挿入活性ペプチドの相互作用メカニズム評価：ペプチド濃度、相互作用時間など種々の条件を変えたペプチドの細胞挿入活性分析に成功した。また、細胞表層の相互作用標的候補となる硫酸化多糖類とペプチドとの相互作用を評価する研究を開始できた。

今後の研究の推進方策

平成25年度は、現在のレベルではμMの濃度を必要とする細胞挿入ペプチドが多く知られているが、ナノ粒子に固定化集積化することにより、ｎMオーダーの少量で細胞挿入活性を示すペプチド群に性能発展させる。これらのリガンドを利用し、細胞検査チップ開発に向けた挑戦的萌芽研究を行う。１．細胞挿入活性ペプチドの相互作用メカニズム評価と低濃度で高活性を示すペプチドナノ粒子の検討：TatやオリゴArgなど現在のレベルではμMの濃度を必要とする細胞挿入ペプチドが多く知られているが、ナノ粒子に固定化・集積化することにより、ｎMオーダーの少量で細胞挿入活性を示すペプチド群に性能発展させる。この高機能化が成功すれば、より好感度の細胞相互作用ペプチドリガンドが獲得できる。２．細胞検査用ペプチドチップ創製：設計したαへリックスペプチドの細胞挿入活性のペプチド配列による挿入活性の違いをパターン解析し、細胞ごとの細胞フィンガープリントとする。同じペプチドでも細胞が異なることにより細胞挿入活性が異なることで、様々なカラーバーコードパターンを作成できる。細胞検査に適したペプチド群の組み合わせについて、種々細胞アッセイを繰り返して見つけ出す検討を行う。これらペプチド群を基板上に配置する研究やナノ粒子による高機能化ペプチドの配置化も検討する。また分化状態の異なる細胞に対しても活性の違いにより細胞分化を識別できるようペプチド群を検討する。細胞を検査できるペプチドバイオチップとしての萌芽研究を行う。

次年度の研究費の使用計画

平成24年度未使用額　559,243円、平成25年度請求額　1,100,000円、合計平成25年度使用額　1,659,243円である。
物品費　1,359,243円（試薬、器具類）、旅費　300,000円（成果発表、調査研究）を使用し、平成25年度は、現在のレベルではμMの濃度を必要とする細胞挿入ペプチドが多く知られているが、ナノ粒子に固定化集積化することにより、ｎMオーダーの少量で細胞挿入活性を示すペプチド群に性能発展させる。これらのリガンドを利用し、細胞検査チップ開発に向けた挑戦的萌芽研究を行う。

研究成果

• [雑誌論文] Systematic Screening of the Cellular Uptake of Designed alpha-Helix Peptides (2013)
  • 著者名/発表者名: Kenji Usui, Takuya Kikuchi, Masayasu Mie, Eiry Kobatake, Hisakazu Mihara
  • 雑誌名: Bioorg. Med. Chem. 巻: 21 ページ: 2560-2567
  • 査読あり
• [雑誌論文] A Peptide Release System using a Photo-cleavable Linker in a Cell Array Format for Cell-toxicity Analysis (2013)
  • 著者名/発表者名: Takashi Kakiyama, Kenji Usui, Kinya Tomizaki, Masayasu Mie, Eiry Kobatake, Hisakazu Mihara
  • 雑誌名: Polymer J. 巻: 45 ページ: 535-539
  • DOI: doi:10.1038/pj.2013.20
  • 査読あり
• [学会発表] αヘリックスペプチド結合金ナノ粒子を用いた細胞導入と細胞選択的ドラッグデリバリ (2012)
  • 著者名/発表者名: Park Hyejin,堤浩,三原久和
  • 学会等名: 第49回ペプチド討論会
  • 発表場所: 鹿児島
  • 年月日: 20121107-09
• [学会発表] 細胞透過性ペプチド結合金ナノ粒子の細胞との相互作用評価 (2012)
  • 著者名/発表者名: 西村仁孝, Hyejin Park,堤浩,三原久和
  • 学会等名: 第61回高分子討論会
  • 発表場所: 名古屋
  • 年月日: 20120919-21