研究課題
Xenopus tropicalisにおける遺伝子の特異的な破壊を行うため、まず、Zinc Finger Nuclease法による遺伝子破壊を検討した。まず、実験に供するXenopus tropicalisの系統のkiss2配列をPCR法にて増幅、正確な塩基配列を決定した。その配列情報を元に、ゲノム上で二重鎖切断を引き起こすと予想されるin vitroでの切断を試みたが、複数作成したzinc finger nucleaseのなかでkiss2配列を選択的に破壊する物は見られなかった。そこで、zinc finger nucleaseの後発かつ、切断効率が良いとされるtranscription activator-like effector nuclease (TALEN)法およびCRISPR法を試みた。認識する配列が自由に設計できる上、毒性も低いとされているが、原理自体は当初の計画に記したものとほぼ同じである。今年度は、研究室で日常的に飼育しているメダカを用いてTALEN技術を試みたところ、TALEN mRNAによって、極めて効率的にGnRH1遺伝子を破壊することに成功した。同様にして、kiss1, gnrh1, gnrh2, gnrh3, lh, fsh, rfrp, it, vt, npff, npyaのTALENと受容体遺伝子kiss2, gpr54-1, gpr54-2, eraについてもCRISPRによる遺伝子ノックアウトメダカの作成に成功した。そこで、これと同じように、2種類のTALENを合成し、mRNAとしてインジェクションし、Xenopus tropicalisにおいてkiss2遺伝子を欠失した個体を作成中である。
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