| 研究概要 |
本研究は, クランプ分子を結晶化シャペロンとして利用したタンパク質の新規結晶化技術の開発である. PCNAなどのクランプは一般に3量体のリング構造を形成する. クランプは, 分子の対称性が高いこと, それ自身が比較的容易に結晶化することから結晶化シャペロンとして有用であると考えた. 本研究計画では, 部位特異的変異導入によって会合状態の異なるDNAクランプを作成し, それらを結晶化したい目的タンパク質に融合させ, クランプを結晶化シャペロンとして利用できる系を確立する. 本研究が開発する結晶化技術は, タンパク質の結晶化における有効な選択肢の1つになると期待できる.
クランプを結晶化シャペロンとして, 目的タンパク質をクランプ分子のC末端に融合させ, さらにアフィニティー精製用のHISタグを付加できるベクタ-, クランプ分子のN末端にHISタグを付加させたベクター, クランプ分子のN末端にHISタグを付加させ, タグを切断させるためにHRV3Cプロテアーゼの認識サイトを挿入したベクター, さらに部位特異的変異を導入してクランプ分子の会合状態を変えたベクター, これらの作製を完了した. Protein-XとProtein-Yをモデルたんぱく質として, 結晶化シャペロン融合タンパク質の調製・結晶化・X線実験を行った. Protein-Xについては3.0オングストローム分解能程度の回折を示す結晶を得ることに成功した. Protein-Yについては, 様々な系を検討し, 最終的に2.6オングストローム分解能の回折強度データを得ることに成功した.
本研究で開発した結晶化シャペロンベクターの有効性が確認でき, 様々なタンパク質への応用が期待できる. 今後はリンカーの長さやアフィニティータグの種類と位置, プロテアーゼサイトの検討によってベクターのヴァージョンアップを図る.
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