研究課題
本申請研究では，巨大タンパク質・ヒドロゲナーゼのNi-Fe 活性部位における水素活性化の反応中間体を，中性子結晶解析法により直接観察することを主目的とする．また，水素を分解した後の産物・プロトンのタンパク質中の移動経路の解明を目指している．平成24年度は，下記の3点について研究を遂行した．１．重水溶液中での [NiFe]ヒドロゲナーゼの結晶化条件の改良．本実験を試みた結果，平成23年度までに得られていた方法で，2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)を結晶化沈殿剤として，5mm3の単結晶調製に成功した．また，MPDが酸化されると4-hydroxy-4-methyl-2-pentanone(HMPO)が生成され，それがヒドロゲナーゼを変性させることなどを見出した．２．酸素耐性膜結合型 [NiFe]ヒドロゲナーゼの重水緩衝溶液中での結晶化．本実験については，現時点では良好な結晶化条件は見出されていない．今後，さらに多くの条件で結晶化スクリーニングするために十分な量の酵素試料の調製条件の検討が急務である．３．巨大単結晶の高圧下における凍結条件のスクリーニングおよび結晶還元条件の確立． これまでの研究では，酵素にCO を結合させることで，活性部位に基質・水素をトラップできることが判明している．この方法で基質の反応水素を活性部位に固定することを目的に，回折実験を80 Kあるいはそれ以下（30 K 程度）の低温で行うための条件検討を行った．その結果，上記１で得られた単結晶（5.0 mm3）に大きなダメージを与えることなく凍結することに成功し，実験室X線装置を用いて1.4 A分解能のX線回折像を得ることに成功した．平成25年度は，上記１～３についてさらに研究を推進したい．
2: おおむね順調に進展している
研究計画に記載されている3つの課題のうち１と３について，下記のように概ね順調に進行しているからである．１．重水溶液中での [NiFe]ヒドロゲナーゼの結晶化条件の改良．本実験で，2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)を結晶化沈殿剤として，これまでで最も大きな5mm3の単結晶調製に成功した．２．酸素耐性膜結合型 [NiFe]ヒドロゲナーゼの重水緩衝溶液中での結晶化．本実験については，現在，実験計画を練り直している．３．巨大単結晶の高圧下における凍結条件のスクリーニングおよび結晶還元条件の確立． 上記１で得られた単結晶（5.0 mm3）に大きなダメージを与えることなく凍結することに成功し，実験室X線装置を用いて1.4 A分解能のX線回折像を得ることに成功した．
研究計画に記載されている3つの課題のうち１～３について，下記のように研究を進めていきたい．１．重水溶液中での [NiFe]ヒドロゲナーゼの結晶化条件の改良．本実験で，2-methyl-2,4-pentanediol(MPD)を結晶化沈殿剤として，重水中においてさらに大きくて良質の単結晶の調製を目指す．平成25年度中にそのような単結晶の調製に成功した場合には，海外機関での中性子回折実験の申請および実施も考慮したい．２．酸素耐性膜結合型 [NiFe]ヒドロゲナーゼの重水緩衝溶液中での結晶化．本実験については，現在，酵素試料の発現系の構築を進めてる．これに成功すれば，結晶化ロボットを使って結晶化条件のスクリーニングを開始したい．３．巨大単結晶の高圧下における凍結条件のスクリーニングおよび結晶還元条件の確立． これまでの技術の蓄積で巨大結晶についても大きなダメージを与えることなく凍結することに成功している．上記２で得られる予定の重水緩衝溶液注の巨大結晶についても問題なく凍結処理が可能と考えている．
該当なし
すべて 2013 2012
すべて 雑誌論文 (14件) (うち査読あり 9件) 学会発表 (15件) (うち招待講演 6件)
生物物理
巻: 53-2 ページ: 82-85
Food. Chem.
巻: 138 ページ: 1551-1556
org/10.1016/j.foodchem.2012.10.074
Biochem. Byophys. Res. Commun.
巻: 430 ページ: 284-288
10.1016/j.bbrc.2012.10.136
Proc. Jpn. Acad., Ser. B
巻: 89 ページ: 16-33
10.2183/pjab.89.16
J. Biol. Chem.
巻: 287
10.1074/jbc.M112.387134
FEBS Letters
巻: 586 ページ: 3705- 3709
10.1016/j.febslet.2012.08.029
Acta Crystallogr
巻: F68 ページ: 675-677
10.1107/S1744309112015692
Dalton Transactions
巻: 41 ページ: 11378-11385
10.1039/C2DT30893B
巻: 287 ページ: 29175-29183
10.1074/jbc.M112.381897
Biochemistry
巻: 51 ページ: 8608-8616
10.1021/bi3011303
酸素耐性ヒドロゲナーゼの構造化学的研究－酵素分子に見出された活性保護機構－
巻: 11 ページ: 67-72
SPring-8利用者情報誌
巻: 17 ページ: 105-110
SPring-8 Research Frontier 2011
巻: 2011 ページ: 5-6
日本結晶学会誌
巻: 54 ページ: 270-275
