細胞内タンパク質の微小な構造変化を可視化する手法の開発

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24657101
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 今村 博臣 京都大学, 白眉センター, 准教授 (20422545)
• キーワード: バイオセンサー / 抗体 / アセチルCoA / 蛍光タンパク質

研究概要

微小なタンパク質の構造変化を識別する抗体を用いたアセチルCoAのFRETバイオセンサーの開発を目指した。前年度までに、グリホサートアセチル転移酵素（GAT）のアセチルCoA結合状態を識別する一本鎖抗体（scFv）を得た。そこで、最終年度では、GATとscFvおよび２種類の蛍光タンパク質が１本のポリペプチドとして作られるよう組換え遺伝子を作製した。この遺伝子を大腸菌で発現させ、さらに産物である人工融合タンパク質を精製した。次に、精製タンパク質の蛍光スペクトルを蛍光分光器を用いて解析した。その結果、GATに結合するscFvを用いた際には、結合しないscFvを用いた場合と比べ、FRET効率は大幅に上昇していた。しかし、GATに結合するscFvを用いた人工融合タンパク質のFRET効率は、アセチルCoAの有無で変化せず、常に高いFRET効率を示した。これは、このscFvがアセチルCoAに結合していないGATに対しても弱いながら結合能を有しているためだと考えられた。並行して、最もFRET効率が高くなるGAT、scFv（VH + VL）および蛍光タンパク質の並びを検討した。その結果、YFP-VH-VL-YFP-GATの並びとなった時に、最もFRET効率が高くなることを見出した。scFvやGATあるいは両者を繋ぐリンカー配列に変異を導入してGATとscFvの相互作用を減らすことにより、アセチルCoAに応答してFRET効率の変化を可能にで出来ると考えられた。

研究成果

• [雑誌論文] Evaluation of intra-mitochondrial ATP levels identifies G0/G1 switch gene 2 as a positive regulator of oxidative phosphorylation (2014)
  • 著者名/発表者名: Kioka, H, Kato, H, Fujikawa, M, Tsukamoto, O, Suzuki, T, Imamura, H, Nakano, A, Higo, S, Yamazaki, S, Matsuzaki, T, Takafuji, K, Asanuma, H, Asakura, M, Minamino, T, Shintani, Y, Yoshida, M, Noji, H, Kitakaze, M, Komuro, I, Asano, Y, Takashima, S
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A 巻: 111(1) ページ: 273-8
  • DOI: 10.1073/pnas.1318547111
  • 査読あり
• [雑誌論文] Glucose-stimulated single pancreatic islets sustain increased cytosolic ATP levels during initial Ca2+ influx and subsequent Ca2+ oscillations (2014)
  • 著者名/発表者名: Tanaka, T, Nagashima, K, Inagaki, N, Kioka, H, Takashima, S, Fukuoka, H, Noji, H, Kakizuka, A, Imamura, H
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 289 ページ: 2205-2216
  • DOI: 10.1074/jbc.M113.499111
  • 査読あり
• [雑誌論文] ATP increases within the lumen of the endoplasmic reticulum upon intracellular Ca2+-release (2014)
  • 著者名/発表者名: Vishnu, N, Jadoon Khan, M, Karsten, F, Groschner, LN, Waldeck-Weiermair, M, Rost, R, Hallström, S, Imamura, H, Graier, WF, Malli, R
  • 雑誌名: Molecular Biology of the Cell 巻: 25 ページ: 368-379
  • DOI: 10.1091/mbc.E13-07-0433
  • 査読あり
• [雑誌論文] Genetically encoded fluorescent thermo-sensors for visualizing subcellular thermoregulation in living cells (2013)
  • 著者名/発表者名: Kiyonaka, S, Kajimoto, T, Sakaguchi, R, Shinmi, D, Omatsu-Kanbe, M, Matsuura, H, Imamura, H, Yoshizaki, T, Hamachi, I, Morii, T, Mori, Y
  • 雑誌名: Nature Meth 巻: 10(12) ページ: 1232-8
  • DOI: 10.1038/nmeth.2690
  • 査読あり
• [雑誌論文] Role of PFKFB3-driven glycolysis in vessel sprouting (2013)
  • 著者名/発表者名: De Bock, K, Georgiaudou, M, Schoors, S, Kuchnio, A, Rita Cantelmo, A, Wong, RW, Quaegebeur, A, Ghesquiére, B, Cauwehberghs, S, Eelen, G, Phng, LK, Betz, I, Tembuyser, B, Brepoels, K, Welti, J, Geudens, I, Segura, I, Cruys, B, Bifari, F, Decimo, I, Blanco, R, Wyns, S, Vangindertael, J, Rocha, S, Collins, R, Munck, S, Daelemans, D, Imamura, H, Devlieger, R, Rider, M, Van Veldhoven, PP, Schuit, F, Bartrons, R, Hofkens, J, Fraisi, P, Telang, S, DeBerardinis, RJ, Schoonjans, L, Vinckier, S, Chesney, J, Gerhardt, H, Dewerchin, M, Carmeliet, P
  • 雑誌名: Cell 巻: 154(3) ページ: 651-63
  • DOI: 10.1016/j.cell.2013.06.037
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo fluorescent adenosine 5’-triphosphate (ATP) imaging of Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans by using a genetically encoded fluorescent ATP biosensor optimized for low temperatures (2013)
  • 著者名/発表者名: Tsuyama, T, Kishikawa, J, Han, YW, Harada, Y, Tsubouchi, A, Noji, H, Kakizuka, A, Yokoyama, K, Uemura, T, Imamura, H.
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 巻: 85 ページ: 7889-7896
  • DOI: 10.1021/ac4015325
  • 査読あり
• [学会発表] 蛍光ATPバイオセンサーを用いたATP代謝の解析
  • 著者名/発表者名: 今村博臣
  • 学会等名: 第50回日本臨床分子医学会学術集会
  • 発表場所: 東京国際フォーラム
  • 招待講演
• [学会発表] 蛍光ATPバイオセンサーATeamを用いた膵島エネルギー代謝の解析
  • 著者名/発表者名: 今村博臣
  • 学会等名: 第13回Islet Biology 研究会
  • 発表場所: 日本都市センターホテル
  • 招待講演
• [学会発表] ATPイメージングによる生細胞内ミトコンドリア機能の評価
  • 著者名/発表者名: 今村博臣
  • 学会等名: 日本生化学会第86回年会
  • 発表場所: パシフィコ横浜
  • 招待講演
• [学会発表] 膵臓ランゲルハンス島におけるATPとCa2+の同時イメージング
  • 著者名/発表者名: 田中喬、今村博臣
  • 学会等名: 日本生体エネルギー研究会 第39回討論会
  • 発表場所: 静岡県コンベンションアーツセンター
• [学会発表] 膵臓ランゲルハンス島におけるATPとCa2+の同時イメージング
  • 著者名/発表者名: 今村博臣
  • 学会等名: 第3回 発生におけるエネルギー代謝を考える会
  • 発表場所: 熊本大学
• [備考] インスリン分泌における重要因子が変動する様子を可視化
  • URL: http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/news_data/h/h1/news6/2013_1/140130_2.htm