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2012 年度 実施状況報告書

電子線結晶構造解析によるクーロンポテンシャルの可視化

研究課題

研究課題/領域番号 24657111
研究種目

挑戦的萌芽研究

研究機関独立行政法人理化学研究所

研究代表者

米倉 功治  独立行政法人理化学研究所, 米倉生体機構研究室, 准主任研究員 (50346144)

研究期間 (年度) 2012-04-01 – 2015-03-31
キーワード構造生物学 / 結晶構造解析
研究概要

生体マシンの作動原理の解明、創薬への応用を目指し、生体分子が機能を発現する上で本質的に重要な因子となるクーロンポテンシャルの可視化を行う。X線は原子の電子雲に散乱されるのに対して、電子は原子のクーロンポテンシャルに散乱される。クーロン力は長距離に渡って作用するため、いろいろな生命活動に大きな影響を及ぼす。例えば、プロトン輸送やイオンの配位、蛋白質の安定性、化学反応にも深く関与している。本研究では、蛋白質のごく薄い三次元結晶の電子線回折から、そのクーロンポテンシャルマップを得る新技術の開発を目指している。クーロンポテンシャルは、X線結晶構造解析では得ることのできない情報であり、これまでに実験的に測定する汎用的な手法は存在しない。
本年度は、肝臓カタラーゼ、筋小胞体Ca2+-ATPaseのごく薄い三次元結晶の電子線回折回転写真を撮影、回折パターンを、開発したプロラムで処理し、プロファイルフィッティングにより正確な強度を求めた。次に、結晶格子、方位を精密化するプログラムを新たに開発し、適用した。多くの結晶からの回折パターンを統合した強度データに対して分子置換を行うことで、カタラーゼとCa2+-ATPaseのそれぞれ3 Åと3.5 Å分解能のクーロンポテンシャルマップの取得に成功した。得られたマップでは、アミノ酸側鎖、金属イオン、水分子等が明瞭に解像できた(論文準備中)。現在、電荷の影響が大きく現れる低角側のデータを含めた密度マップと低角側を含めないものとの比較から、電荷を持つ残基を同定し、分子の作動機構をより詳細に解析することを目指している。また、重原子置換体から電子線回折を集め、位相情報の取得を進めている。結晶化の試みでX線回折には適さない非常に薄い結晶しか得られないこともある。開発する技術により、これらの結晶から新規の構造が解析可能となる汎用性の高い技術としても確立する。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本年度は、牛肝臓カタラーゼ、ウサギ筋小胞体Ca2+-ATPaseのごく薄い三次元結晶の電子線回折の回転写真から、初期クーロンポテンシャルマップの取得を目標とした。電子線の波長はX線と比べて50分の1以下であり、X線結晶構造解析で用いられている回折データの処理ソフトを使用することができないことが分かっていた。そのため、電子線回折パターンからプロファイルフィッティングにより正確な積分強度を抽出するプログラムの独自開発を進めていたが、本年度はこのプログラムの改良に加えて、結晶格子、方位を精密化するプログラムを新規開発し、計画通りに完了することができた。次に、上記プログラムにより処理した多数の異なる回転シリーズの強度情報を、X線結晶構造解析で使われているソフトウェアにより統合し、分子置換により密度マップを計算した。以上から、薄い三次元結晶からのクーロンポテンシャルマップの取得に世界で初めて成功した。それぞれ、3 Åと3.5 Å分解能のカタラーゼとCa2+-ATPaseの密度マップには、アミノ酸側鎖、金属イオン(カタラーゼではヘム中心の鉄原子、Ca2+-ATPaseでは2つのカルシウム原子)、水分子を明瞭に解像することができた。電子顕微鏡では試料ホルダーの構造及び試料形態の制限から、試料を約±60°までしか傾斜できない。特に、薄い結晶のように支持膜に同一の面で吸着する試料では、データを収集できない円錐状の領域(ミッシングコーン)が残ってしまう。今回用いた回折データは全回折点の70%程度であったが、得られたクーロンポテンシャルマップでは、ミッシングコーンの影響は少なく深刻な問題とはならないことが分かった。以上から、当初計画した以上に順調に解析が進んでいると考える。

今後の研究の推進方策

X線と比較して荷電粒子である電子の散乱因子は、電荷を持つ場合、特に低角側で大きく異なる。従って、この領域のデータを含めた密度マップと含めないものを比較することで、電荷の分布を解析できる可能性が指摘されている(1, 2)。今後、カタラーゼとCa2+-ATPaseの回折データを用いて、アミノ酸側鎖の荷電の状態を詳細に解析し、分子の機能に及ぼすクーロン力の影響を詳細に解析する。
結晶化の試みで、X線回折には適さない非常に薄い結晶しか得られないこともある。薄い結晶から新規の構造が解析可能となる汎用性の高い技術として確立することを目指して、重原子置換体からの電子線回折の集める他、電子顕微鏡で実像を一部撮影し、位相情報の取得を試みる。さらに、細菌のいろいろな生命活動にプロトンやナトリウムイオンの流れをエネルギーとして供給する膜蛋白質ファミリーの結晶化を行い、薄い結晶が得られた場合、電子線回折による新規構造の解明を目指す。
(1) Kimura Y., Vassylyev D. G., Miyazawa A., Kidera A., Matsushima M., Mitsuoka K., Murata K., Hirai T. & Fujiyoshi Y. Nature 389: 206-211 (1997).
(2) Mitsuoka K., Hirai T., Murata K., Miyazawa A., Kidera A., Kimura Y. & Fujiyoshi Y. J. Mol. Biol. 286: 861-882 (1999).

次年度の研究費の使用計画

重原子置換体や新規試料の結晶の回折データを測定するため、東京大学分子細胞生物学研究所への出張旅費に使用する。また、電子顕微鏡試料のサポートに用いる穴の開いたカーボン膜グリッド、結晶試料の調製のための試料調製、結晶化に用いる試薬等を購入する。他に、構造解析に用いるPCワークステーションを導入する。24年度は解析プログラムの開発に重点を置いており、回折データも以前から撮り貯めて置いたものを用いた。今後、多くデータ測定を要し、そのための消耗品、試薬、PC等を必要とする。

  • 研究成果

    (13件)

すべて 2013 2012 その他

すべて 雑誌論文 (2件) 学会発表 (10件) (うち招待講演 3件) 備考 (1件)

  • [雑誌論文] 非結晶粒子のコヒーレントX線回折イメージング2012

    • 著者名/発表者名
      中迫雅由、高山裕貴、苙口友隆、白濱圭也、関口優希、山本雅貴、米倉功治、引間孝明、眞木さおり、高橋幸生、鈴木明大、松永幸大、加藤翔一、星貴彦
    • 雑誌名

      レーザー研究

      巻: 40 ページ: 680-686

  • [雑誌論文] X線自由電子レーザーを用いた非結晶粒子のコヒーレントX線回折イメージング実験2012

    • 著者名/発表者名
      中迫雅由、高山裕貴、苙口友隆、白濱圭也、関口優希、山本雅貴、米倉功治、引間孝明、眞木さおり、高橋幸生、鈴木明大、松永幸大、加藤翔一、星貴彦
    • 雑誌名

      月刊OPTRONICS

      巻: 31 ページ: 101-106

  • [学会発表] 電子線とX線による生体超分子構造の解析2013

    • 著者名/発表者名
      米倉功治
    • 学会等名
      平成24年度「分子システム研究」成果報告会
    • 発表場所
      理研和光(埼玉)
    • 年月日
      20130226-20130227
  • [学会発表] Structure Analysis of Biological Macromolecular Complexes by Electron- and X-rays2013

    • 著者名/発表者名
      K. Yonekura
    • 学会等名
      The 5th Biennale RIKEN Joint Retreat “Behavior - from Molecules, Cell to Organisms -"
    • 発表場所
      YAMAHA Resort Tsumagoi (Shizuoka)
    • 年月日
      20130204-20130205
    • 招待講演
  • [学会発表] Electron Crystallography of 3D Protein Crystals2013

    • 著者名/発表者名
      K. Yonekura, C. Toyoshima
    • 学会等名
      Nagoya Symposium - Frontiers in Structural Physiology
    • 発表場所
      Nagoya University (Nagoya)
    • 年月日
      20130122-20130124
  • [学会発表] Cryo-Electron Microscopy of Biological Macromolecular Structures2013

    • 著者名/発表者名
      K. Yonekura, S. Maki-Yonekura
    • 学会等名
      4-th France-Japan Joint Seminar "Imaging of spatiotemporal hierarchies in living cells - an overview of dynamics from molecules to cells -"
    • 発表場所
      RIKEN SPring-8 Center (Hyogo)
    • 年月日
      20130106-20130111
    • 招待講演
  • [学会発表] 細菌のイオン共役型エネルギー供与体の構造基盤研究2012

    • 著者名/発表者名
      渡邊真宏、米倉功治
    • 学会等名
      第35回日本分子生物学会年会
    • 発表場所
      福岡国際会議場・マリンメッセ福岡(福岡)
    • 年月日
      20121211-20121214
  • [学会発表] 低温電子顕微鏡法による生体超分子複合体の構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      米倉功治、眞木さおり
    • 学会等名
      第13回医学生物学電子顕微鏡学会
    • 発表場所
      チサンホテル新大阪(大阪)
    • 年月日
      20121124-20121124
    • 招待講演
  • [学会発表] Purification and crystallization of bacterial ion-coupled energizing protein ExbB2012

    • 著者名/発表者名
      M. Watanabe, K. Yonekura
    • 学会等名
      The 2012 Annual Meeting of American Crystallographic Association
    • 発表場所
      Boston(MA), USA
    • 年月日
      20120728-20120801
  • [学会発表] イオン共役型エネルギー供与体ExbB/ExbDおよびTonB/ExbB複合体の結晶化構造解析2012

    • 著者名/発表者名
      渡邊真宏、米倉功治
    • 学会等名
      第12回蛋白質科学会
    • 発表場所
      名古屋国際会議場(名古屋)
    • 年月日
      20120620-20120622
  • [学会発表] 細菌のイオン共役型エネルギー供与体の構造基盤研究2012

    • 著者名/発表者名
      渡邊真宏
    • 学会等名
      分子システム研究」第1回春合宿
    • 発表場所
      浜名湖ロイヤルホテル(静岡)
    • 年月日
      20120522-20120523
  • [学会発表] 生体の作動機構をより高い分解能で“見る”2012

    • 著者名/発表者名
      米倉功治
    • 学会等名
      分子システム研究」第1回春合宿
    • 発表場所
      浜名湖ロイヤルホテル(静岡)
    • 年月日
      20120522-20120523
  • [備考] 米倉生体機構研究室

    • URL

      www.riken.jp/research/labs/rsc/photon_sci/biostruct_mech/

URL: 

公開日: 2014-07-24  

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