電子線結晶構造解析によるクーロンポテンシャルの可視化

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24657111
• 研究機関: 独立行政法人理化学研究所
• 研究代表者: 米倉 功治 独立行政法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 准主任研究員 (50346144)
• 研究分担者: 眞木 さおり 独立行政法人理化学研究所, 放射光科学総合研究センター, 研究員 (20513386)
• キーワード: 構造生物学 / 結晶構造解析

研究概要

生体マシンの作動原理の解明、創薬への応用を目指し、生体分子が機能を発現する上で本質的に重要な因子となるクーロンポテンシャルの可視化を行っている。X線は原子の電子雲に散乱されるのに対して、電子は原子のクーロンポテンシャルに散乱される。クーロン力は長距離に渡って作用するため、いろいろな生命活動に大きな影響を及ぼす。例えば、プロトン輸送やイオンの配位、蛋白質の安定性、化学反応にも深く関与している。本研究では、蛋白質のごく薄い三次元結晶の電子線回折から、そのクーロンポテンシャルマップを得る新技術の開発を目指している。クーロンポテンシャルは、X線結晶構造解析では得ることのできない情報であり、これまでに実験的に測定する汎用的な手法は存在しない。
25年度は、筋小胞体Ca2+-ATPase、牛肝臓カタラーゼのごく薄い三次元結晶から集めた電子線回折パターンより得た、それぞれ3.4 Åと3.2 Å分解能のクーロンポテンシャルマップを詳細に解析し、アミノ酸側鎖、金属イオンの荷電状態の可視化に成功した（論文準備中）。また、位相情報の取得のため重原子置換体から電子線回折を集めた。以上により、非常に薄い結晶から新規構造の解析を可能とする新しい技術として確立することを目指す。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

電子顕微鏡では試料ホルダーの構造及び試料形態の制限から、試料を約±60°までしか傾斜できない。特に、薄い結晶のように支持膜に同一の面で吸着する試料では、データを収集できない円錐状の領域（ミッシングコーン）が残ってしまう。この結果、得られる密度マップの分解能は膜に垂直な方向に悪くなる。この問題に対して、非結晶学的対称単位の平均や密度改変法（density modification）を適用することで、密度マップを改善できることがわかった。さらに、電子線の散乱因子の与え方を工夫することで、筋小胞体のCa2+-ATPase、カタラーゼのアミノ酸側鎖の荷電状態、金属イオンの酸化状態の同定に成功している（論文準備中）。また、位相情報の取得のため重原子置換体からの電子線回折の測定を行った。以上から当初計画通りに順調に研究が進んでいると考える。

今後の研究の推進方策

重原子置換体の解析を進め、位相情報の取得が可能性を確認する。さらに、より高傾斜のデータ測定が可能になるよう新型試料ホルダーの開発、試料サポート検討を進めていく。新規試料結晶からの回折データの取得も並行し、非常に薄い結晶から構造解析可を行う汎用性の高い技術としても確立する。

次年度の研究費の使用計画

25年度は、構造解析プログラムの開発とデバグ、開発したプログラムを用いた解析を行う必要が生じた。26年度に試料の結晶化及び試料サポートの検討を行い、重原子置換体や新規試料の結晶からの回折データの取得を本格的に進めるのが適当と判断したため。
重原子置換体や新規試料の結晶からの回折データを測定するため、東京大学分子細胞生物学研究所への出張旅費に使用する。また、試料サポートの検討や、電子顕微鏡試料のサポートに用いる穴の開いたカーボン膜グリッド、結晶化に用いる試薬等を購入する。

研究成果

• [雑誌論文] X線自由電子レーザーを用いた非結晶粒子のコヒーレントX 線回折イメージング (2014)
  • 著者名/発表者名: 中迫雅由, 苙口友隆, 関口優希, 小林周, 橋本早紀, 白濱圭也, 山本雅貴, 高山裕貴, 米倉功治, 眞木さおり, 引間孝明, 高橋幸生, 鈴木明大, 松永幸大, 乾弥生, 登野健介, 亀島敬, 城地保昌, 犬伏雄一, 星貴彦
  • 雑誌名: 日本結晶学会誌 巻: 56 ページ: 27-35
• [雑誌論文] Post-transcriptional regulator Hfq binds catalase HPII: crystal structure of the complex (2013)
  • 著者名/発表者名: Yonekura, K., Watanabe, M., Kageyama, Y., Hirata, K., Yamamoto, M. and Maki-Yonekura, S.
  • 雑誌名: PLOS ONE (2013) 巻: 8 ページ: e78216 (7)
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0078216
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure and activity of the RNA-targeting Type III-B CRISPR-Cas complex of Thermus thermophilus (2013)
  • 著者名/発表者名: Staals, R. H. J., Agari, Y., Maki-Yonekura, S., Zhu, Y., Taylor, D. W., van Duijn, E., Barendregt, A., Vlot, M., Koehorst, J. J., Sakamoto, K., Masuda, A., Dohmae, N., Schaap, P. J., Doudna, J. A., Heck, A. J. R., Yonekura, K., van der Oost, J. and Shinkai, A.
  • 雑誌名: Molecular Cell 巻: 52 ページ: 135-145
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2013.09.013
  • 査読あり
• [雑誌論文] KOTOBUKI-1 apparatus for cryogenic coherent X-ray diffraction imaging (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakasako, M., Takayama, Y., Oroguchi, T., Sekiguchi, Y., Kobayashi, A., Shirahama, K., Yamamoto, M., Hikima, T., Yonekura, K., Maki-Yonekura, S., Kohmura, Y., Inubushi, Y., Takahashi, Y., Suzuki, A., Matsunaga, S., Inui, Y., Tono, K., Kameshima, T., Joti, Y. and Hosh, T.
  • 雑誌名: Rev. Sci. Instrum. 巻: 84 ページ: 093705 (11)
  • DOI: 10.1063/1.4822123
  • 査読あり
• [雑誌論文] 低温電子顕微鏡法による蛋白質構造の可視化 (2013)
  • 著者名/発表者名: 米倉功治, 眞木さおり
  • 雑誌名: 感染 炎症 免疫 巻: 43 ページ: 307-312
• [学会発表] 電子顕微鏡による三次元再構成 (2014)
  • 著者名/発表者名: 米倉功治
  • 学会等名: X線自由電子レーザー重点課題 「SACLAにおける低温X線回折イメージング実験の展開と標準化」 コヒーレントＸ線回折イメージングにおけるデータ収集と構造解析の現状と将来
  • 発表場所: 慶應義塾大学 (神奈川県)
  • 年月日: 20140319-20140320
• [学会発表] 蛋白質の薄い三次元結晶の電子線結晶構造解析 (2014)
  • 著者名/発表者名: 米倉功治
  • 学会等名: 平成25年度「分子システム研究」研究報告会
  • 発表場所: 理化学研究所 (埼玉県)
  • 年月日: 20140218-20140219
• [学会発表] SACLAにおける低温Ｘ線回折イメージング- べん毛、大腸菌等 - (2013)
  • 著者名/発表者名: 米倉功治, 眞木さおり, 高山裕貴
  • 学会等名: X線自由電子レーザー重点課題 「SACLAにおける低温Ｘ線回折イメージング実験の展開と標準化」 第二回会合
  • 発表場所: 理化学研究所 (埼玉県)
  • 年月日: 20130808-20130809
• [学会発表] SPring-8 - 医療分野での展望 - (2013)
  • 著者名/発表者名: 米倉功治
  • 学会等名: 兵庫県保険医協会姫路･西播支部第28回支部総会・記念講演会, 姫路, 7月 (2013)
  • 発表場所: 西はりま地場産業センター (兵庫県)
  • 年月日: 20130720-20130720
  • 招待講演
• [図書] SPring-8 - 医療分野での展望 - (2013)
  • 著者名/発表者名: 米倉 功治
  • 総ページ数: 1
  • 出版者: 兵庫保険医新聞
• [備考] 理化学研究所ホームページ
  • URL: http://www.riken.jp/pr/press/2013/20131107_1/