| 研究課題/領域番号 |
24657120
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 石川県立大学 |
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研究代表者 |
海老原 充 石川県立大学, 生物資源環境学部, 准教授 (80232974)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | ポリロイシン / 膜タンパク質 / GPCR / 味覚受容体 / うま味受容体 |
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| 研究概要 |
近年、受容体は細胞外ドメインや細胞内ドメインなどで相互作用することで膜移行が促進されたり、ヘテロダイマー形成が行われたりすることが明らかになってきている。一方、うま味受容体は、T1R1・T1R3ヘテロダイマーを形成して機能することが知られているが、どの領域で相互作用しているかなどの詳細についての報告は皆無である。
そこで、本研究では、T1R1・T1R3相互作用領域を解明するために、個々のドメインを発現するドメインライブラリーを作成し、どのドメインが相互作用に関与しているかを明らかにし、そのメカニズムを解明することを目的とした。
24年度は、ドメインライブラリーの有効性を検証するために、うま味受容体T1R1およびT1R3（7回膜貫通型GPCR）の個々の膜貫通ドメインではなく、すべての膜貫通ドメインを含む領域をクローニングし、それらをGatewayクローニング法により、発現ベクターpcDNA6.2/v5-DESTへと組み込んだ。その際、split GFP法によるアッセイが可能となるよう、GFPのN末側およびC末側を連結させた。さらに、膜移行が行われるように、これらのクローンのN末側にはシグナル配列を連結させた。
以上のように構築した発現系を用いてsplit GFP解析を行うことにより、25年度に実施する予定のドメインライブラリー作製の有効性が検証されると期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ヒトT1R1およびT1R3の各ドメインを含むsplit GFP解析用発現ベクターを作製するための、エントリークローンの作製はすでに終了した。これらのエントリークローン組み合わせて、発現ベクターpcDNA6.2/v5-DESTにクローニングすることにより、ドメインライブラリーが完成する。当初計画では、これらドメインライブラリーを完成させるとともに、種々の動物由来のT1R1およびT1R3のクローニングを完成させるとしていたが、クローニングが完了したものは数種の哺乳類であった。
以上の結果から、70％の到達度と評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
24年度に完了しなかった哺乳類由来のT1R1およびT1R3のクローニングを行う。同時に、すでに完成したヒトT1R1およびT1R3のすべての膜貫通ドメインを持つsplit GFP解析用クローンを用いたアッセイを行う。また、各動物由来のドメインライブラリーを作製する前に、ヒトドメインライブラリーを先行して解析し、この結果をもとにして、ターゲットとなる膜貫通ドメインを限定し、split GFP用クローン構築の優先順位を決定する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
25年度は、split GFP解析のための細胞培養を中心に研究費を分配する。主な使途としては、培地および血清、アッセイ用プレートなどの消耗品とする。
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