染色体凝縮異常によって生じる二核四倍体細胞に誘導される新規細胞死の解析

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24657132
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 米原 伸 京都大学, 生命科学研究科, 教授 (00124503)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: 細胞死 / eEF1A1

研究概要

我々は、染色体の凝縮異常が誘導する二核四倍体細胞（がん化に向かう危険な細胞とされる）が、翻訳伸長因子eEF1A1 (EF-1α)の発現抑制による非アポトーシス細胞死で除去されることを見いだしてきた。この細胞死を誘導する系としてチャイニーズハムスター由来CHO細胞を用い、外来性CREBを活性化させる系（CREB-ER発現細胞を4OHT処理する系）で構築していたが、研究を進めるためには遺伝子やその発現の解析が進んでいるヒトやマウスの細胞を用いることが必要であると考え、マウスNIH3T3細胞、マウスBalb3T3細胞、ヒトU2OS細胞で同じ細胞死を誘導する系を確立した。これらの細胞では、染色体の凝縮異常が誘導する二核四倍体細胞（がん化に向かう危険な細胞とされる）を誘導することが可能であり、翻訳伸長因子eEF1A1 (EF-1α)の発現抑制による非アポトーシス細胞死で除去されることを確認した。
また、二核四倍体細胞においてはeEF1A1 mRNAがP body (Processing body) に集積しeEF1A1の発現抑制を誘導するが、この集積を可視化することによって細胞死を検出する方法の開発を進めた。具体的には、eEF1A1 mRNAのP bodyへの移行を支配する配列と強固なRNA結合タンパク質L7Aeの結合配列の両方を有するmRNA、L7Aeとsplit GFP (N末側)を融合した遺伝子と、P body構成タンパク質にsplit GFP (C末側)をつなげた遺伝子を、CREB-ERを発現させたCHO細胞やマウス3T3細胞に発現させることを試みている。現時点では、各遺伝子のクローニング、適度な量の遺伝子発現を誘導するプロモーターの確定を行っている。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

ヒトやマウスの細胞で新規細胞死を誘導する系を確立することに成功したので、この点では順調に進展しているが、これらの細胞を用いた細胞死誘導の分子機構解析の開始が遅れている。平成25年度早々に開始し、結果を得たい。
また、この細胞死の可視化を実現する系の構築においては、各種ｃDNAのクローニングや発現ベクターの選別等は終了したが、実際に機能する事典までは進んでいない。この系においても、平成25年度早々に実現させたい。

今後の研究の推進方策

染色体の凝縮異常が誘導する二核四倍体細胞（がん化に向かう危険な細胞とされる）が、翻訳伸長因子eEF1A1 (EF-1α)の発現抑制による新しい非アポトーシス細胞死で除去されことをる見いだしている。この細胞死の原因となるeEF1A1の発現抑制がmRNAの5’UTR配列特異的なP bodyへの移行に媒介されるので、そのmRNAの5’UTR領域特異的に結合する因子を解明し、その細胞死への影響を明かにする。
また、このeEF1A1 mRNAのP bodyへの移行をsplit GFPシステムを用いて検出する方法を確立し、この細胞死がin vitroで増殖している細胞の一部に恒常的に誘導されているかを解明する。

次年度の研究費の使用計画

基本的には、研究試薬、抗体、細胞培養用培地・器具などの購入に使用するため物品費として使用する。

研究成果

• [雑誌論文] Protease activity of procaspase-8 is essential for cell survival by inhibiting both apoptotic and nonapoptotic cell death dependent on receptor interacting protein kinase 1 (RIP1) and RIP3. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kikuchi M, Kuroki S, Kayama M, Sakaguchi S, Lee KK, Yonehara S
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 287 ページ: 41165-41173
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.419747
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of a mechanism that couples multisite phosphorylation of Yes-Associated Protein (YAP) with transcriptional coactivation and regulation of apoptosis. (2013)
  • 著者名/発表者名: Lee KK, Yonehara S
  • 雑誌名: Journal of Biological Chemistry 巻: 287 ページ: 9568-9578
  • DOI: 10.1074/jbc.M111.296954
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dclk1 distinguishes between tumor and normal stem cells in the intestine. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakanishi Y, Seno H, Fukuoka A, Ueo T, Yamaga Y, Maruno T, Nakanishi N, Kanda K, Komekado H, Kawada M, Isomura A, Kawada K, Sakai Y, Yanagita M, Kageyama R, Kawaguchi Y, Taketo MM, Yonehara S, Chiba T
  • 雑誌名: Nature Genetics 巻: 45 ページ: 98-103
  • DOI: 10.1038/ng.2481
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fas deficiency in mice with the Balb/c background induces blepharitis with allergic inflammation and hyper-IgE production in conjunction with severe autoimmune disease. (2013)
  • 著者名/発表者名: Takahashi S
  • 雑誌名: Int Immunol 巻: 25 ページ: 287-293
  • DOI: doi: 10.1093/intimm/dxs109
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of a novel type 2 innate immunocyte with ability to enhance IgE production. (2013)
  • 著者名/発表者名: Fukuoka A
  • 雑誌名: Int Immunol 巻: 25 ページ: in pressc
  • DOI: doi:10.1093/intimm/dxs160
  • 査読あり
• [備考] 京都大学大学院 生命科学研究科 高次遺伝情報学分野
  • URL: http://www.lif.kyoto-u.ac.jp/labs/Fas/Home_j.htm
• [備考] 京都大学大学院生命科学研究科
  • URL: http://www.lif.kyoto-u.ac.jp/j/