人工酵素ＺＦＮを用いたユニバーサル遺伝子改変システムの開発

2013 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24657156
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 山本 卓 広島大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (90244102)
• キーワード: バイオテクノロジー / ゲノム編集

研究概要

平成25年度は以下の研究を行った。
１）人工ヌクレアーゼとしてTALENシステムを導入し、その効率的作製方法を確立した。この方法を用いて作製したTALENを利用して、線虫、ショウジョウバエ、ウニ、ホヤ、カエル、イモリ、マウス、ラットにおける標的遺伝子破壊を成功させた。これらの成果をまとめ、日本発生生物学会の機関誌へ投稿し、ゲノム編集の特集号に掲載された。
２）哺乳類でのゲノム編集の効率化を図るために、高活性型のTALEN(Platinum TALEN)の開発を行なった。このTALENを用いることによって、従来変異導入効率が低かった哺乳類において高頻度に変異導入ができることを示した。
３）カエルにおいて、２組のPlatinum TALENを用いて、２つの遺伝子を同時に破壊することに成功した。
４）第３世代のゲノム編集ツールであるCRISPR/Cas9システムを利用して、培養細胞およびマウスでの遺伝子破壊を試みた。培養細胞では複数のガイドRNAを発現するベクターシステムを確立し、１つのベクターをトランスフェクションするだけで複数の遺伝子を破壊できることを示した。
５）ゲノム編集によって目的の遺伝子へレポーター遺伝子を挿入する方法を確立した。TALENによってTyr遺伝子を切断し、そこへCMVプロモーターでドライブされるGFP遺伝子を挿入し、アルビノにする一方でGFP蛍光を発するカエル胚の作製に成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

人工ヌクレアーゼとしてZFNからTALENに変えることによって、作製効率が大幅に上昇した。その結果、様々な動物（ウニ、ホヤ、カエル、マウス、ラットなど）での遺伝子破壊の成功例を示すことができた。さらに、本年度開発した高活性型TALEN(Platinum TALEN)は、様々な動物での遺伝子破壊を実現するシステムとして内外から高く評価された。

今後の研究の推進方策

遺伝子破壊に加えて、標的遺伝子へのノックインシステムを確立する。成功例は出ているものの、ノックイン効率は未だ低い状況であるので、来年度はノックインの効率化を目指す。

研究成果

• [雑誌論文] TALEN-induced gene knock out in Drosophila. (2014)
  • 著者名/発表者名: Kondo T, Sakuma T, Wada H, Akimoto A, Yamamoto T and Hayashi S
  • 雑誌名: Dev Growth Differ 巻: 56 ページ: 86-91
  • DOI: 10.1111/dgd.12097
  • 査読あり
• [雑誌論文] TALENs efficiently disrupt the target gene in Iberian ribbed newts (Pleurodeles waltl), an experimental model animal for regeneration. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hayashi T, Sakamoto K, Sakuma T, Yokotani N, Inoue T, Kawaguchi E, Agata K, Yamamoto T and Takeuchi T
  • 雑誌名: Dev Growth Differ 巻: 56 ページ: 115-121
  • DOI: 10.1111/dgd.12103
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted mutagenesis in sea urchin embryos using TALENs. (2014)
  • 著者名/発表者名: Hosoi S, Sakuma T, Sakamoto N and Yamamoto T
  • 雑誌名: Dev Growth Differ 巻: 56 ページ: 92-97
  • DOI: 10.1111/dgd.12099
  • 査読あり
• [雑誌論文] Targeted mutagenesis of multiple and paralogous genes in Xenopus laevis using two pairs of TALENs. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sakane Y, Sakuma T, Kashiwagi K，Kashiwagi A, Yamamoto T and Suzuki K
  • 雑誌名: Dev Growth Differ 巻: 56 ページ: 108-114
  • DOI: 10.1111/dgd.12105
  • 査読あり
• [雑誌論文] Versatile strategy for isolating TALEN-mediated knockout mutants in Caenorhabditis elegans. (2014)
  • 著者名/発表者名: Sugi T, Sakuma T, Ohtani T and Yamamoto T
  • 雑誌名: Dev Growth Differ 巻: 56 ページ: 78-85
  • DOI: 10.1111/dgd.12108
  • 査読あり
• [雑誌論文] Tissue-specific and ubiquitous gene knockouts in Ciona by electroporating TALENs provide new approaches to investigate gene functions (2014)
  • 著者名/発表者名: Treen N, Yoshida K, Sakuma T, Sasaki H, Kawai N, Yamamoto T and Sasakura Y
  • 雑誌名: Development 巻: 141 ページ: 481-487
  • DOI: 10.1242/dev.099572
  • 査読あり
• [雑誌論文] TALEN-mediated single-base-pair editing identification of an intergenic mutation upstream of BUB1B as causative of PCS (MVA) syndrome (2014)
  • 著者名/発表者名: Ochiai H, Miyamoto T, Kanai A, Hosoba K, Sakuma T, Kudo Y, Asami K, Ogawa A, Watanabe A, Kajii T, Yamamoto T and Matsuura S
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci U S A 巻: 111 ページ: 1461-1466
  • DOI: 10.1073/pnas.1317008111
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficient TALEN construction and evaluation methods for human cell and animal applications. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sakuma T, Hosoi S, Woltjen K, Suzuki KI, Kashiwagi K, Wada H, Ochiai H, Miyamoto T, Kawai N, Sasakura Y, Matsuura S, Okada Y, Kawahara A, Hayashi S and Yamamoto T
  • 雑誌名: Gene Cells 巻: 18 ページ: 315-326
  • DOI: 10.1111/gtc.12037
  • 査読あり
• [雑誌論文] roduction of Sry knockout mouse using TALEN via oocyte injection. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kato T, Miyata K, Sonobe M, Yamashita S, Tamano M, Miura K, Kanai Y, Miyamoto S, Sakuma T, Yamamoto T, Inui M, Kikusui T, Asahara H, Takada S
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 3 ページ: 3136
  • DOI: 10.1038/srep03136
  • 査読あり
• [雑誌論文] Repeating pattern of non-RVD variations in DNA-binding modules enhances TALEN activity. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sakuma T, Ochiai H, Kaneko T, Mashimo T, Tokumasu D, Sakane Y, Suzuki K, Miyamoto T, Sakamoto N, Matsuura S and Yamamoto T
  • 雑誌名: Sci Rep 巻: 3 ページ: 3379
  • DOI: 10.1038/srep03379
  • 査読あり
• [学会発表] Platinum TALENの開発と様々な動物におけるゲノム編集
  • 著者名/発表者名: 山本卓
  • 学会等名: 理研シンポジウム「ゲノムデザイン技術と疾患モデル研究」
  • 発表場所: つくば
  • 招待講演
• [学会発表] 人工ヌクレアーゼを用いた両生類でのゲノム編集
  • 著者名/発表者名: 山本卓
  • 学会等名: 日本動物学会第84回大会シンポジウム「生物実験材料としてのネッタイツメガエルの長所と有用性」
  • 発表場所: 岡山
  • 招待講演
• [学会発表] 高活性型TALENの開発と哺乳類培養細胞および動物での標的遺伝子改変
  • 著者名/発表者名: 山本卓
  • 学会等名: 第65回日本生物工学会シンポジウム「次世代の植物バイオテクノロジー」
  • 発表場所: 広島
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集革命ー人工ヌクレアーゼを利用した遺伝子改変技術の開発
  • 著者名/発表者名: 山本卓
  • 学会等名: 平成25年度広島バイオフォーラム「ここまで進んだゲノム科学とその活用」
  • 発表場所: 広島
  • 招待講演
• [学会発表] ゲノム編集技術の限りない可能性
  • 著者名/発表者名: 山本卓
  • 学会等名: 染色体工学研究センター研究成果発表会
  • 発表場所: 東京
  • 招待講演
• [備考] 分子遺伝学研究室
  • URL: http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/index.html
• [備考] ゲノム編集コンソーシアム
  • URL: http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/genome_editing/index.html
• [産業財産権] 核酸挿入用ベクター (2013)
  • 発明者名: 鈴木賢一、坂根祐人、佐久間哲史、山本卓
  • 権利者名: 鈴木賢一、坂根祐人、佐久間哲史、山本卓
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2013-230349
  • 出願年月日: 2013-11-06