| 研究課題/領域番号 |
24658005
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
村田 稔 岡山大学, 資源植物科学研究所, 教授 (20166292)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 相同組み換え / ターゲッティング / Cre/LoxP / GFP / シロイヌナズナ |
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| 研究概要 |
本研究では、植物ではこれまで低頻度でしか起こらなかった相同組換えを高頻度で誘発し、効率的な遺伝子ターゲッティング法の確立を目的としている。そのため、本研究ではまずシロイヌナズナを材料に、二種類のコンストラクトを作成した。一つは、ターゲッティングコンストラクトで、バイナリーベクターのボーダー配列内に２つのLoxPを配置し、その間にクローニングサイト（CS）を組み込んでおき、ターゲットとするゲノム配列や特定遺伝子を挿入できるようにしたものである。これには、マーカー遺伝子としてGFP(緑色蛍光タンパク質)遺伝子を、CaMV35Sプロモーターと切り離して配置し、LoxP間の組換えにより、GFPが発現するよう工夫した。二つめは、Creリコンビナーゼの過剰発現コンストラクトであり、核移行シグナルを含むCre遺伝子はCaMVの35SプロモーターとΩ要素にドライブされ過剰に発現するようデザインした。これらのコンストラクトをFAST法によりシロイヌナズナの実生に共感染させ、Creリコンビナーゼによって、GFPが一過的に発現するかを調べた。その結果、子葉の一部にGFPのシグナルが観察され、LoxP間の組換えが誘発されたことが示唆された。しかしこの場合、T-DNAが縦列して染色体に挿入されたことも考えられたため、PCRにより、この領域を増幅し、塩基配列を調べたところ、LoxP間の組換えが誘発されていることが明らかとなった。組換えを起こしたT-DNAが子葉細胞内でどのような挙動を取っているかについては、現在調査中であるが、環状化し核内にとどまっていることも推定される。現在は、縦列型の反復配列をコンストラクトにクローニングし、同様の実験を進めている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画されたコンストラクトが作成され、これを用いた研究が進展しているため
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| 今後の研究の推進方策 |
コンストラクトの有効性を探るため、シロイヌナズナの一過的な発現系（FAST）を利用しているが、データにややバラツキが生じる難点がある。より安定な系を確立する予定である。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
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