| 研究課題/領域番号 |
24658011
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 独立行政法人農業生物資源研究所 |
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研究代表者 |
雑賀 啓明 独立行政法人農業生物資源研究所, その他部局等, 研究員 (20435613)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | ジーンターゲッティング / 変異導入 / マーカー除去 |
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| 研究概要 |
ジーンターゲッティング（GT）は、標的遺伝子を計画通りに改変することができる遺伝子組換え技術である。特に、GTによって標的遺伝子に点変異だけを導入することができれば、遺伝子を破壊することができるだけではなく、遺伝子機能を多様に改変することが可能である。しかしながら、従来のGT技術では、GTに成功した細胞を選抜するために使用した外来性の選抜マーカー（ポジティブ選抜マーカー）が必ず標的遺伝子内部または近傍に残ってしまう。よって、標的遺伝子の発現やその機能に影響を及ぼす可能性が考えられる。そこで、本研究では、標的遺伝子に点変異だけを残す技術を構築するために、マーカー遺伝子など余分な配列が完全に除去された細胞や個体を効率よく濃縮する技術を開発することを目的とする。
これまでに、β-エストラジオール依存的に標的配列にDNA二重鎖切断を誘導することができる形質転換イネを作出した。また、イネ内在性のポジティブ選抜マーカー遺伝子を利用し、標的配列のDNA二重鎖切断に伴う相同組換え（HR）／単鎖アニーリング（SSA）イベントを検出し、さらにそのようなイベントが生じた細胞を濃縮するマーカーコンストラクトを作出した。このベクターを上記の誘導的DNA二重鎖切断イネに形質転換を行った。一方、このマーカーシステムを有するイネを作出しておけば、今後の標的遺伝子への点変異導入実験の材料として幅広く利用することが可能である。そこで、イネ内在性のポジティブ選抜マーカー遺伝子を、HR／SSAイベントを検出・濃縮するマーカーコンストラクトに改変するようなGT実験を行うため、GT用ベクターの構築を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の計画通り、実験を遂行することができた。現在のところ、研究の推進や進捗に対して大きな問題はないと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
(1) イネ内在性の薬剤耐性遺伝子を利用したHR／SSA検出マーカーの開発
昨年度作出した形質転換カルスを利用して、標的配列のDNA二重鎖切断に伴うHR／SSAイベントが生じた細胞を濃縮することが可能であるかどうか調査する。すなわち、β-エストラジオールを処理することで、薬剤に耐性を示す細胞を選抜することができるかどうか調べる。また、このシステムを利用して、異なる遺伝子座に存在するマーカー遺伝子が除去された細胞を濃縮することができるかどうか調査する。一方、GT実験によって、イネ内在性のポジティブ選抜マーカー遺伝子を、HR／SSAイベントを検出・濃縮するマーカーコンストラクトに改変したイネ系統の作出を試みる。
(2) 重複配列を持つベクターを用いたGT実験
(1)でマーカー除去システムが機能することが示された場合、モデルGT実験を行い、不要な選抜マーカーを除去することができるかどうか検証する。以上の結果をまとめ、本研究で提唱した内在性標的遺伝子に点変異だけを導入する汎用的なGT技術についてデータを取り纏める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今年度から研究補助者を雇用するため、人件費・謝金を計上した。研究補助者には、イネの形質転換やデータ解析等を分担して行って頂く予定である。また、形質転換実験やGT実験に必要な試薬を購入するため、消耗品を多く計上した。
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