| 研究課題/領域番号 |
24658099
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| 研究機関 | 福岡大学 |
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研究代表者 |
見明 史雄 福岡大学, 薬学部, 教授 (50248522)
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| 研究分担者 |
鹿志毛 信広 福岡大学, 薬学部, 教授 (80185751)
佐藤 朝光 福岡大学, 薬学部, 助教 (90369025)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 乳酸菌 / CTB-YVAD融合体 / 抗炎症作用 / 炎症性腸疾患 |
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| 研究概要 |
本研究の目的は、caspase-1の活性化を阻害するYVAD（チロシン-バリン-アラニン-アスパラギン酸）をCholera Toxin B subunit (CTB)との融合体として分泌する乳酸菌を作出し、炎症性腸疾患 (IBD)の治療薬として応用することにある。平成24年度は、大腸菌と乳酸菌のシャトルベクターpHIL253を作製した後、CTBおよびCTB-YVAD融合タンパク質を分泌するLactobacillus caseiを作出した。L. caseiに分泌させたCTBおよびCTB-YVADは、Vibrio choleraeが産生するCTBと同様に、GM1-gangliosideに結合することを確認した。さらに、CTB-YVADの生理活性を検討するために、培養上清からのCTBおよびCTB-YVADの精製を行った。L. caseiに分泌させたCTB-YVADがGM1-gangliosideに結合したことから、申請者の予測どおり、CTB-YVADは容易にヒトおよびマウス細胞内に侵入し、caspase-1の活性化を阻害できる可能性が高い。したがって、平成24年度の研究により、新たなIBD治療薬となり得る遺伝子組換え乳酸菌を作出することができた。
本研究では、CTB-YVADの抗炎症作用を評価するために、Caco-2細胞においてLPSにより誘発されるcaspase-1の活性化、IL-1bの遊離を指標とする。また、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の自由飲水により誘発されるマウス大腸炎の効果も検討する。平成24年度は、その前段階として、LPSのCaco-2細胞への曝露によりcaspase-1が活性化されることをその酵素活性を測定することで、IL-1bの遊離が増大することをELISA法を用いて確認した。さらに、DSSの投与により大腸炎を発症するマウスの作製に成功した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的を達成するためには、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する遺伝子組換え乳酸菌を作出する」、「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」の3項目を実施する必要がある。本年度の研究により、それぞれの項目について、以下の結果を得ることができたため、おおむね順調に進展していると判断した。
「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する遺伝子組換え乳酸菌を作出する」：GM1-gangliosideに対する結合能を有するCTB-YVADおよびCTBを分泌する遺伝子組換えL. caseiを作出した。
「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」：CTB-YVADおよびCTBを分泌する遺伝子組換えL. caseiの培養上清からのCTB-YVADおよびCTBの精製に成功した。また、精製したCTB-YVADの抗炎症作用をin vitroで評価する前段階として、ヒト腸管上皮細胞株Caco-2にLPSを曝露することで、caspase-1の活性およびIL-1bの遊離が増大することを確認した。
「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」：CTB-YVADを分泌する乳酸菌の治療効果を検討する前段階として、IBDモデルマウスを作製することに成功した。具体的には、6週齢の雄性C57BL/6Nマウスに5%デキストラン硫酸ナトリウムを7日間自由飲水させることで、体重減少、下痢、血便、大腸の短縮、腸管におけるミエロペルオキシダーゼ活性の増大、炎症性サイトカインの発現誘導を観察することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」、「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」の2項目を実施する。
「精製したCTB-YVAD融合体タンパク質の抗炎症作用をin vitroで確認する」：Caco-2細胞にLPSおよび精製したCTB-YVAD、CTBを曝露し、caspase-1の活性化、IL-1bの遊離を指標に、in vitroにおける抗炎症作用を評価する。
「CTB-YVAD融合タンパク質を分泌する乳酸菌のIBDモデルマウスに対する治療効果を検討する」：平成24年度の研究成果により作製したIBDモデルマウスに、CTB-YVADを分泌する遺伝子組換えL. caseiを経口投与し、大腸炎が改善されるか検討する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
次年度の研究費として、消耗品1,950千円を使用する予定である。具体的には、電気泳動やイムノブロッティング等に必要な一般試薬に200千円を、遺伝子組換え等に必要な制限酵素等の酵素類に200千円を、細菌や細胞の培養に必要な培地成分、血清等の培地類に300千円を、イムノブロッティングやELISAに必要な抗体類に300千円を、実験用マウス購入費用に200千円を、実験に必要なマイクロチューブ、チップ、培養器具類などプラスチック器具類に300千円が必要である。その他、学会発表を行うための旅費として100千円を、実験補助のための人件費として150千円を外国語論文の校閲費や印刷費などに、200千円を試算している。
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