ＴＡＬＥを利用した配列特異的な遺伝子発現抑制法及び欠失変異導入法の確立

2014 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24658283
• 研究機関: 立命館大学
• 研究代表者: 竹田 篤史 立命館大学, 生命科学部, 准教授 (60560779)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: ゲノム編集 / 植物 / TALEN

研究実績の概要

本研究では、植物で効率よく働くTranscription activator-like nuclease (TALEN)の系を構築した。本研究の成果は以下の1～3の通りである。1. Arabidopsis thalianaのコドン頻度に最適化したTALE骨格を構築した。我々が構築した系は、「異なるエピトープタグの付加により各TALENの検出が容易」、「イントロンの挿入によるアグロバクテリウム内での異所発現の防止」、「ヘテロダイマー型のFokI-DNA切断ドメインの利用によるOff-target効果の低減」、「各Repeat variable di-residuesユニットへのサイレント変異導入により、連結後のTALEN全長のシークエンス解析が可能」などの特徴を持つ。2. 構築したTALENが植物細胞内で標的のDNA配列に結合するかどうかを確認するために、Nicotiana benthamianaを用いた一過的ルシフェラーゼアッセイ系を構築した。この系では、連結したTALEのDNA結合ドメインにAvrBs3遺伝子の転写活性化ドメインを付加したものを用いた。この系の構築により、植物を形質転換する前段階で、構築したTALENが核内で標的のDNA領域に結合するかどうかを判断することが可能となった。我々の構築したTALE系を転写活性化研究に用いることも可能となった。3. 構築したTALENの系を用いて、A. thalianaとN. benthamianaのゲノム編集を行った。N. benthamianaのTOM1/TOM3遺伝子、A. thalianaのMIRNA遺伝子座を標的に、欠失変異体の単離を試みた。PCRとシークエンス解析によって欠失変異の導入を確認したが、劣性ホモ植物の選抜までは完了しなかった。研究期間は終了したが、これらの変異体植物の解析を進めた後、成果を発表したいと考えている。

研究成果

• [雑誌論文] Roles and programming of Arabidopsis ARGONAUTE proteins during Turnip mosaic virus infection (2015)
  • 著者名/発表者名: Garcia-Ruiz H., Carbonell A., Hoyer S. J., Fahlgren N., Gilbert K. B., Takeda A., Giampetruzzi A., Garcia-Ruiz M. T., McGinn M. G., Lowery N., Baladejo M. T. M. and Carrington J. C.
  • 雑誌名: PLoS Pathogens 巻: 11 ページ: e1004755
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1004755
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Localization of tobacco germin-like protein 1 in leaf intercellular space (2014)
  • 著者名/発表者名: Kishi-Kaboshi M., Muto H., Takeda A., Murata T., Hasebe M. and Watanabe Y.
  • 雑誌名: Plant Physiology and Biochemistry 巻: 85 ページ: 1-8
  • DOI: 10.1016/j.plaphy.2014.10.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Studies on molecular mechanisms of RNA silencing-mediated anti-virus defense in plants and RNA silencing suppression by plant viruses (2014)
  • 著者名/発表者名: Takeda A.
  • 雑誌名: Journal of General Plant Pathology 巻: 80 ページ: 527-528
  • DOI: 10.1007/s10327-014-0548-9
• [雑誌論文] Recovery of dicer-like 1-late flowering phenotype by miR172 expressed by the non-canonical DCL4-dependent biogenesis pathway (2014)
  • 著者名/発表者名: Tsuzuki M., Takeda A. and Watanabe Y.
  • 雑誌名: RNA 巻: 20 ページ: 1320-1327
  • DOI: 10.1261/rna.044966.114
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] AGO1-ウイルス由来siRNAの標的遺伝子予測を目指して (2015)
  • 著者名/発表者名: 唐戸俊介、白谷公孝、都筑正行、渡邊雄一郎、竹田篤史
  • 学会等名: 第100回日本植物病理学会
  • 発表場所: 明治大学（東京都・千代田区）
  • 年月日: 2015-03-29
• [学会発表] 植物microRNAの特異性に関する研究 (2014)
  • 著者名/発表者名: 唐戸俊介、都筑正行、白谷公孝、渡邊雄一郎、竹田篤史
  • 学会等名: 第78回日本植物学会
  • 発表場所: 明治大学（神奈川県・川崎市）
  • 年月日: 2014-09-12 – 2014-09-14
• [学会発表] miR172強制発現によるシロイヌナズナDicer-like 1変異体の部分相補 (2014)
  • 著者名/発表者名: 都筑正行、竹田篤史、渡邊雄一郎
  • 学会等名: 第78回日本植物学会
  • 発表場所: 明治大学（神奈川県・川崎市）
  • 年月日: 2014-09-12 – 2014-09-14