血漿中微量発現プロテオーム濃縮法の開発

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24659017
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 石濱 泰 京都大学, 薬学研究科(研究院), 教授 (30439244)
• キーワード: プロテオーム / 分析科学 / 蛋白質 / 血清プロテオーム

研究概要

in vitroリン酸化反応とその後のリン酸化ペプチド濃縮により、タンパク質混合物試料中のタンパク質組成を自由に操作し、低発現量タンパク質の検出感度を向上させる新規手法を開発し、血清・血漿プロテオミクスに応用することを目的とし、前年度から引き続き検討を行った。高発現血清タンパク抗体カラムを用いて、ある程度高発現タンパクを除去したヒト標準血清試料を用い、本法による人工リン酸化血清プロテオームと対照試料である血清プロテオーム解析をショットガンプロテオミクスの手法を用いて行ったところ、今まで同定されたことのなかったサイトカイン類が同定可能となり、当初の目的を達成することができた。さらに、本法を定量系に適用すべく検討を行う過程で、人工リン酸化・リン酸化濃縮によって試料の複雑性が激減することにより定量性が著しく向上することが分かった。そこで、培養細胞を用いて、通常では定量が困難な低発現リン酸化ペプチドを標的とし、リン酸化濃縮・脱リン酸化・人口リン酸化タグ付加・リン酸化濃縮というステップに基づくターゲットペプチドの定量システムを構築した。様々なMSのデータ取得手法との組み合わせや高分離能LCとのカップリングでシステムを最適化し、シグナル伝達パスウェイ上の複数のリン酸化分子を同時に定量することを試みた。その結果、EGF刺激したHeLa細胞中で時間とともに変動するリン酸化分子の動態プロファイルを取得することに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Discovery of colorectal cancer biomarker candidates by membrane proteomic analysisand subsequent verification using selected reaction monitoring and tissue microarrayanalysis (2014)
  • 著者名/発表者名: Kume, H.; Muraoka, S.; Kuga, T.; Adachi, J.; Narumi, R.; Watanabe, S.; Kuwano, M.; Kodera, Y.; Matsushita, K.; Fukuoka, J.; Masuda, T.; Ishihama, Y..; Matsubara, H.; Nomura, F.; Tomonaga, T.
  • 雑誌名: Mol Cell Proteomics 巻: M113 ページ: 037093
  • DOI: 10.1074/mcp.M113.037093
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hydrophilic Interaction Chromatography Using Meter-scale Monolithic Silica Capillary Column for Proteomics LC-MS. (2014)
  • 著者名/発表者名: Horie K, Kamakura T, Ikegami T, Wakabayashi M, Kato T, Tanaka N, Ishihama Y.
  • 雑誌名: Anal Chem 巻: 86 ページ: 3817-24
  • DOI: 10.1021/ac4038625
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quantitation of cellular phosphorylation dynamics by phosphoproteomics approaches. (2014)
  • 著者名/発表者名: Ishihama Y, Imami K
  • 雑誌名: Yakugaku Zasshi (Japanese). 巻: 134 ページ: 521-7
  • DOI: 10.1248/yakushi.13-00251-4
  • 査読あり
• [雑誌論文] Phosphoproteome Analysis of Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded Tissue Sections Mounted on Microscope Slides (2013)
  • 著者名/発表者名: Wakabayashi M, Yoshihara H, Masuda T, Tsukahara M, Sugiyama N, Ishihama Y.
  • 雑誌名: J Proteome Res. 巻: 13 ページ: 915-24
  • DOI: 10.1021/pr400960r
  • 査読あり
• [雑誌論文] p38-Mediated phosphorylation of Eps15 endocytic adaptor protein. (2013)
  • 著者名/発表者名: Zhou Y, Tanaka T, Sugiyama N, Yokoyama S, Kawasaki Y, Sakuma T, Ishihama Y, Saiki I, Sakurai H.
  • 雑誌名: FEBS Lett. 巻: 588 ページ: 131-137
  • DOI: 10.1016/j.febslet.2013.11.020.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Atg38 is required for autophagy-specific phosphatidylinositol 3-kinase complex integrity (2013)
  • 著者名/発表者名: Araki Y, Ku WC, Akioka M, May AI, Hayashi Y, Arisaka F, Ishihama Y, Ohsumi Y.
  • 雑誌名: J Cell Biol. 巻: 203 ページ: 299-313
  • DOI: 10.1083/jcb.201304123.
  • 査読あり
• [学会発表] メートル長モノリスシリカカラムを用いたLC-MS/MSシステムの開発とヒトプロテオーム一斉解析への挑戦 (2014)
  • 著者名/発表者名: 鎌倉健雄, 市原駿, 堀江勘太, 岩崎未央, 若林真樹, 杉山直幸, 石濱泰
  • 学会等名: 日本薬学会第134年会
  • 発表場所: 熊本大学（熊本）
  • 年月日: 20140327-20140330
• [学会発表] In vitro リン酸化修飾を用いた標的キナーゼ基質の定量的リン酸化プロテオミクス (2013)
  • 著者名/発表者名: 高木俊輔, 吉田繁治, 今村春菜, 若林真樹, 杉山直幸, 石濱泰
  • 学会等名: 第36回日本分子生物学会年会
  • 発表場所: 神戸ポートアイランド
  • 年月日: 20131203-06
• [学会発表] 25ミクロン径のメートル長モノリス型シリカキャピラリーによるプロテオミクスLC-MSシステムの高感度化 (2013)
  • 著者名/発表者名: 市原駿, 岩崎未央, 若林真樹, 杉山直幸, 石濱泰
  • 学会等名: 第24回クロマトグラフィー科学会議
  • 発表場所: 東京大学工学部（東京）
  • 年月日: 20131111-20131113
• [学会発表] In Vitro Phosphorylaton-Assisted In-Depth Human Serum Proteome Analysis (2013)
  • 著者名/発表者名: S. Takagi, H. Imamura, M. Wakabayashi, N. Sugiyama, and Y. Ishihama
  • 学会等名: HUPO 12th Annual World Congress
  • 発表場所: パシフィコ横浜（神奈川）
  • 年月日: 20130914-20130918
• [学会発表] Illuminating cellular phosphorylation through one-shot phosphoproteomics (2013)
  • 著者名/発表者名: Ishihama, Y
  • 学会等名: The 4th Asia Oceania Mass Spectrometry Conference
  • 発表場所: Taipei International Convention Center, Taiwan
  • 年月日: 20130710-12