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研究計画に従って実験を進め、昨年度までにγセクレターゼ活性を修飾する可能性がある候補遺伝子13種を動物細胞発現ベクターに組み込みN末端にFLAGタグまたはC末端にHAエピトープタグ融合したコンストラクトを作製した。これらのベクタープラスミドをAPP安定発現株に遺伝子導入し、各遺伝子の発現の確認まで終了した。初年度において、これらの遺伝子群からAβ42/Aβ40産生比の変化に関与する遺伝子を一つ同定することに成功したが、その他の遺伝子による効果は顕著ではなかった。Aβ産生比は細胞密度によって影響を受け、また使用するメディウム中のFBSの含有率によっても測定値にバラつきが生じるため、トランスフェクションからメディウム回収までの条件検討を行ってきた。具体的には、候補遺伝子をトランスフェクション後48hでメディウムを除去し無血清培地(Neurobasal + B27)に交換後、24時間でAβを定量することにした。トランスフェクション後に培地を交換することには、medium に含まれるトランスフェクション前に分泌されていたAβの量をリセットする目的があり、さらに交換する培地を無血清培地にすることで、候補遺伝子を見出したiPS 細胞から神経細胞への分化の条件に近似し、FBS 中のプロテアーゼやAβ と結合するタンパク質が関与する可能性を除去することができると考えた。しかしながら、上記の方法でAβ量をリセットするとトランスフェクション後に合成されるAβ量が極めて微量でELISAによる検出が困難であったため、本年度はさらなる至適化を進めた。これにより、より精度よくAβ42/Aβ40比の変化を感知できると考えられる。現在、一過性過剰発現系で、Aβ42/Aβ40産生比の解析を再開しているところである。
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