| 研究課題/領域番号 |
24659085
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
吉川 知志 神戸大学, 医学(系)研究科(研究院), 講師 (90244681)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | クロマチン再構成複合体 / 神経細胞分化 |
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| 研究概要 |
交付申請時の平成24年度研究実施計画に基づき、まず、ゼブラフィッシュdpf1 mRNAの発現部位の解析をin situハイブリダイゼーション（ISH）法により行った。その過程で、dpf1遺伝子には転写開始点が異なる複数の転写バリアントが存在することを見出した。これらバリアントは分子内の機能モチーフの有無が異なり、バリアント間で機能性に差異があると予想されるため、機能メカニズムの検討には各バリアントの発現パターンを明らかにする事が極めて重要であると考えられる。現有の抗体は特定のバリアントを選択的に検出することはできないため、それぞれのバリアントを特異的に検出可能なISHプローブの作製を試みた。現在、各バリアントについてISH法による詳細な発現解析を行うとともに、各バリアントに特異的な抗体の作製を準備中である。
次に、dpf1-tTA-GFPトランスジェニックフィッシュにおける tTA-GFP融合タンパク質の発現解析を行い、この融合トランスジーンは内在性dpf1とは異なる独立したトランスクリプトとして転写、翻訳されており、当該トランスジェニックフィッシュにおいても内在性Dpf1タンパク質は野生型同様に発現していると考えられた。この点についても、現在、野生型との間に発現パターンに相違がないか、詳細に確認中である。
モルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチド（MO）を用いた遺伝子ターゲティングによるDpf1の機能解析については、前述のように複数の転写バリアントの存在が明らかになったために発現パターンの解析を優先し、その結果を踏まえてターゲティングの対象とするトランスクリプトならびに用いるMOの配列を決定する事とした。
また、マウスdpf1の発現解析については、ISHプローブ作製用プラスミドのクローニングを行い、解析を始めたところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
前述のように、複数の転写開始点を伴う転写バリアントの存在が新たに明らかになったため、その発現解析を優先して行っており、遺伝子ターゲティングによる個体レベルでのDpf1の機能解析についてはまだ着手していない。確認した転写バリアントの中にはDNA結合モチーフの一部を欠くものも含まれており、バリアント間での機能上の違いが予想される。そのため、各バリアントの発現パターンやDNA結合能の違いなどの分子レベルの知見は、個体レベルでの機能解析を行う上でも極めて重要であると考える。さらに、遺伝子ターゲティングに用いるMOの配列決定のためには、翻訳開始点やエクソン/イントロン構造の情報が必要となる。このように、研究目的の達成度としては申請書の実験計画に比して遅れている点があることは否めないが、研究課題を遂行する上で必要な実験内容を優先して行っている状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでのところ当初の実施計画に比べてやや進捗状況は遅れているが、基本的には交付申請書どおりに研究課題を進める。すなわち、昨年度より取り組んでいる[1]ゼブラフィッシュDpf1の発現パターンの詳細な解析および[2]dpf1-tTA-GFPトランスジェニックフィッシュのGFP発現パターン解析の結果を踏まえて、[3]遺伝子ターゲティングによるDpf1の機能解析を進めていく。ただし、上述のようにゼブラフィッシュDpf1の発現解析をさらに詳細に進める必要が生じているので、ゼブラフィッシュに関する解析を優先的に集中して進める事とし、申請時の実施計画に記した[4]マウスDPF1の中枢神経系における発現パターン解析、および[5]マウスDPF1の中枢神経系における機能解析については、研究全体の進捗状況を見て推進の方策を判断することとする。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
実績の概要欄および研究の推進方策欄に記した通り、各転写バリアントの発現解析結果を踏まえて遺伝子ターゲティングに用いるMOの配列決定を行う事としたため、当該MO購入にかかる研究費を今年度内に執行していない。MOの配列決定が済み次第、次年度使用となった研究費を用いてMOを合成委託し、実験計画を遂行する予定である。
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