研究課題
１）脳特異的にmiRNAを欠損するマウスの作成とarc蛋白質の発現：arc mRNAの3'-UTRに結合するmiRNAは、幾つかのmiRNAをコードする前駆体からプロセシングにより生成される。そこで、この前駆体を脳特異的にノックアウト（KO）するマウスを作成した。野生型マウスとこのKOマウスから脳を摘出し、arc発現量を比較したところ、KOマウス脳においてarc蛋白量が増加していることを確認した。２）arcと結合するユビキチンリガーゼの解析：miRNAによる樹状突起スパインの形態制御機構を解析するためには、arcのスパイン形態制御における役割を調べる必要がある。Arcと結合するユビキチンリガーゼを同定しているので、その解析を進めた。まずユビキチンリガーゼを培養海馬ニューロンに過剰発現させたが、樹状突起スパイン形態や興奮性シナプス密度に有意な変化は見られなかった。しかし、siRNAを用いてユビキチンリガーゼをノックダウンしたところ、典型的なキノコ型スパインはほぼ形成されなくなり、細長い（thin）フィロポディア様の突起へと変化した。さらに、興奮性のシナプス形成も抑制された。これらの結果から、arcと結合するユビキチンリガーゼはスパインおよび興奮性シナプス形成に必要な分子であると考えられた。
2: おおむね順調に進展している
計画通り、１）miRNAを脳特異的に欠損するマウスの作成とarc蛋白発現増加の確認、２）arcと結合するユビキチンリガーゼのスパインおよび興奮性シナプス形成における役割の解析が予定通り進んでいるため。
１）脳特異的miRNAノックアウトマウスにおけるスパイン形態：野生型とmiRNA KOマウスの脳を潅流固定し、その脳切片にDiIをコートした金粒子を遺伝子銃を用いて撃ち込むことにより、海馬CA1ニューロンを可視化する。これらのニューロンを共焦点顕微鏡を用いて観察し、樹状突起スパインの形態を野生型と比較する。２）脳特異的miRNAノックアウトマウスの行動学的解析：miRNA KOマウスの脳内において、arcの発現量が増加していることを既に確認しているので、行動学的異常があるかどうかも解析する。３）ユビキチンリガーゼの標的分子の同定と解析：arcと結合するユビキチンリガーゼの標的分子を同定する。そのためには、この分子と結合する分子を探索する必要がある。既に候補分子を見出しているので、ユビキチンリガーゼとの結合を生化学的に検証する。さらに、arcの有無によって両分子の相互作用が変化するかどうかを検討する。また、この標的候補分子がスパイン形態を制御するかどうかを検証する。
miRNAのノックアウトマウスの作成とarc結合蛋白質の解析が予想以上に順調に進んだが、当初予定していた一部の学会発表と論文発表にはもう少し別のデータが必要と判断し、今年度は見送ったため。物品費：マウスの行動を観察・記録するためのビデオカメラシステム（80万円）を購入予定。マウス脳切片中の樹状突起を標識するための、金粒子（10万円）、初代培養用器具（プラスチックディッシュ、カバーガラス、ピペット、遠心管、観察のためのガラスボトムディッシュなど）（5万円）、poly-L-lysine（3万円）、培養液やサプルメント（7万円）、遺伝子導入試薬（5万円）、抗GFP抗体（5万円）、抗vGlut1抗体（5万円）。生化学実験用試薬（一般試薬、protein A&G、ECL、転写膜など）（20万円）、プラスチックチューブ・チップ（5万円）国内旅費：5万円その他：英文校正（4万円）、投稿料・年会費・振込手数料など（6万円）
すべて 2014 2013 その他
すべて 雑誌論文 (5件) (うち査読あり 4件) 学会発表 (6件) (うち招待講演 1件) 産業財産権 (1件)
J Neurochem.
巻: 128 ページ: 246-55
10.1111/jnc.12470.
BioMed. Res. Int.
巻: 2013 ページ: 564534
10.1155/2013/564534.
World J. Neurol.
巻: 3 ページ: 138-143
10.5316/wjn.v3.i4.138
巻: 3 ページ: 56-61
10.5316/wjn.v3.i3.56
日本薬理学雑誌
巻: 142 ページ: 106-111
