| 研究課題/領域番号 |
24659099
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
服部 明 京都大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (50300893)
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| 研究分担者 |
大石 真也 京都大学, 薬学研究科(研究院), 講師 (80381739)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 脱ユビキチン化酵素 / システインプロテアーゼ / activity-based probe / ユビキチン |
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| 研究概要 |
我々は、脱ユビキチン化酵素活性測定用基質であるユビキチン（Ub）と成熟型グランザイムBとの融合タンパク質（Ub-GrB）に加えて、そのN末端側に別途作製したUbのC末端Gly残基をVal残基に置換したUb（G76V）変異体を3分子連結させたx3Ub(G76V)-Ub-GrBをも作製した。このx3Ub(G76V)-Ub-GrBが脱ユビキチン化酵素活性測定基質として利用できるかどうかをHeLa細胞の細胞抽出液を用いて検討した。その結果、HeLa細胞抽出液の陰イオン交換カラム溶出画分中に含まれるx3Ub(G76V)-Ub-GrB分解活性が1ピークとして認められた。一方、上記画分中のUb-GrB分解活性ならびに市販基質であるUb-AMC分解活性は複数ピークとして得られたことから、x3Ub(G76V)-Ub-GrB基質が特定の脱ユビキチン化酵素に対する活性測定基質としてなりうることが示された。また、x3Ub(G76V)-UbのC末端側に酵素活性中心のSH基によって求核攻撃を受けうる反応官能基を付加したActivity-based probeの作製を試みた結果、反応官能基付加直前の中間体の作製まで完了した。現在、反応性官能基の合成を進めている。同時に、本中間体を用いてx3Ub(G76V)-UbのC末端側に蛍光基質AMCを付加した新規基質x3Ub(G76V)-Ub-AMCについても作製を行った。x3Ub(G76V)-Ub-AMCについてもHeLa細胞抽出液を用いて評価を行った結果、興味深いことにx3Ub(G76V)-Ub-GrBとは異なる活性プロファイルが見出され、これらの基質を利用することで複数個のUb分子の認識してUbエンド結合を切断しうる酵素分子の同定が可能であることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
タンデム型ユビキチンが付加した新しい脱ユビキチン化酵素活性測定用基質を予定通り作製することができた。またその有用性をHeLa細胞の細胞抽出液を用いて示すことができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ほぼ計画通りに遂行する。TNF刺激した細胞を用いて、エンド型DUBの活性動態変化の検出ならびにその責任酵素の同定を進める。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
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