三次元多層細胞構築による動脈硬化における炎症の慢性化機構の解明

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24659100
• 研究機関: 横浜市立大学
• 研究代表者: 横山 詩子 横浜市立大学, 医学部, 講師 (70404994)
• キーワード: 循環器・高血圧 / 生理学 / ナノバイオ / 細胞・組織 / 三次元培養 / 弾性線維

研究概要

[研究目的]新規実験系「三次元多層細胞」を構築して動脈硬化の病態を解明し、効果的な治療の基礎を確立することを目的とする。
[実験手法]三次元積層体の構築：ウィスターラットの新生仔の大動脈から単離した血管平滑筋細胞を用いた。フィブロネクチンとゼラチンの細胞表面の薄膜形成により７層の三次元血管モデルを構築した。10%もしくは1%のFBSを含有したDMEM, DMEM/F-12を用い、培地条件が弾性線維の形成に与える影響を検討した。弾性線維の染色・定量：エラスチカ・ワンギーソン染色を行い、ソフトウェアを用いて、輝度抽出により定量した。また、既存の三次元細胞培養としてスフェロイドを平滑筋細胞で作成し、弾性線維や平滑筋の分化の評価を行った。さらに、三次元平滑筋細胞積層体にマクロファージに分化させた単球系細胞株を共培養して、マクロファージの平滑筋細胞体への影響を検討した。
[結果]培養液の検討と弾性線維の形成：DMEM/F-12 により培養された三次元血管モデルでは７層の構造が形成されなかった。一方、DMEMにより培養されたものでは７層の積層構造と弾性線維の形成が確認された。1%のFBSの条件では10%と比較し、弾性線維の形成が有意に増加した。１％の条件では、弾性線維の構成分子のうちelastinとfibrillin-2のmRNA発現が有意に高かった。平滑筋形質マーカーの発現：単層の細胞と比較し、三次元血管モデルにおいては収縮型の平滑筋マーカーであるSM1のタンパク発現が有意に多く、合成型のマーカーであるSMembの発現が少なかった。また、三次元平滑筋細胞積層体にマクロファージが浸潤し弾性線維を分解していることを、免疫染色でとらえることができた。
[結論]弾性線維を含有する三次元平滑筋細胞体を作製することができた。この三次元血管モデルは血管疾患解明の新たなツールとなることが期待される。

研究成果

• [雑誌論文] Prostaglandin E_2 inhibits elastogenesis in the ductus arteriosus via EP4 signaling (2014)
  • 著者名/発表者名: Yokoyama U, Minamisawa S, Shioda A, Ishiwata R, Jin MH, Masuda M, Asou T, Sugimoto Y, Aoki H, Nakamura T, Ishikawa Y
  • 雑誌名: Circulation 巻: 129 ページ: 487-96
  • DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.113.004726
  • 査読あり
• [雑誌論文] Three-Dimensional Multilayers of Smooth Muscle Cells as a New Experimental Model for Vascular Elastic Fiber Formation Studies (2014)
  • 著者名/発表者名: Ishiwata R, Yokoyama U*, Matsusaki M, Asano Y, Kadowaki K, Ichikawa Y, Umemura M, Fujita T, Minamisawa S, Shimoda H, Akashi M, and Ishikawa Y
  • 雑誌名: Atherosclerosis 巻: 233 ページ: 590-600
  • DOI: 10.1016/j.atherosclerosis.2014.01.045
  • 査読あり
• [雑誌論文] The prostanoid EP4 receptor and its signaling pathway (2013)
  • 著者名/発表者名: Yokoyama U, Iwatsubo K, Umemura M, Fujita T, Ishikawa Y
  • 雑誌名: Pharmacol Rev 巻: 65 ページ: 1010-52
  • DOI: 10.1124/pr.112.007195
  • 査読あり
• [学会発表] Molecular mechanisms of the regulation of vascular elastic fiber formation and development of a new 3D vascular model (2013)
  • 著者名/発表者名: Yokoyama U
  • 学会等名: The 36th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan
  • 発表場所: 神戸国際会議場（兵庫県神戸市）
  • 年月日: 20131203-20131206
  • 招待講演
• [学会発表] 血管弾性線維形成の機序解明に向けた三次元血管壁組織の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 横山詩子
  • 学会等名: 第２回三次元生体組織構築公開シンポジウム
  • 発表場所: 化学会館ホール（東京都千代田区）
  • 年月日: 20131128-20131128
  • 招待講演
• [学会発表] プロスタグランディンＥによる血管弾性線維の制御メカニズムと新たな三次元血管モデルの可能性 (2013)
  • 著者名/発表者名: 横山詩子
  • 学会等名: 国立循環器病研究所セミナー、第18 回NCVC 研究者交流会
  • 発表場所: 国立循環器病研究所（大阪府吹田市）
  • 年月日: 20130927-20130927
  • 招待講演
• [図書] Nanomedicine and Nanotoxicology (2014)
  • 著者名/発表者名: Yokoyama U, Ishikawa Y
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: Springer
• [備考] 横浜市立大学医学部循環制御医学
  • URL: http://www-user.yokohama-cu.ac.jp/~seiri1/
• [産業財産権] 三次元組織体及びその製造方法 (2013)
  • 発明者名: 明石満、松崎典弥、石川義弘、横山詩子
  • 権利者名: 明石満、松崎典弥、石川義弘、横山詩子
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2013-212966
  • 出願年月日: 2013-10-10