ＨＳＰ９０の慢性炎症誘発・維持機構

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24659165
• 研究種目: 挑戦的萌芽研究
• 研究機関: 札幌医科大学
• 研究代表者: 佐藤 昇志 札幌医科大学, 医学部, 教授 (50158937)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2015-03-31
• キーワード: 熱ショック蛋白質 / 自然免疫 / 無菌性炎症 / 樹状細胞 / レセプター

研究概要

1. 細胞外Hsp90 (exHsp90)レセプターのクローニング
マクロファージや樹状細胞を含む抗原提示細胞が細胞外の熱ショック蛋白質HSPを結合・取り込むことにより、自然免疫を活性化し、無菌性炎症を惹起することが知られている。特にexHsp90 は樹状細胞への結合・取り込み効率が高く、さらに抗原提示を促進して獲得免疫の活性化を増強する。本研究では、無菌性炎症に関わるヒト樹状細胞状のHsp90レセプターを同定することで、自然免疫活性・無菌性炎症惹起の分子メカニズムを解明する。
平成24年度はGM-CSFを用いてヒト末梢血単球から誘導した樹状細胞からpoly A (+) RNAを精製したのち、RT-PCRを行い、cDNAを合成した。cDNAを精製後、λZAPIIベクターにライゲーションした。これをXL-1 Blueにtransformationし、200万pfuのcDNAライブラリーを作成した。このcDNAライブラリーをcos7細胞に一過性発現させ、ビオチン化Hsp90との結合性をフローサイトメーターにてスクリーニングした。cDNAを50万クローンスクリーニングしたところ、以下の候補遺伝子を同定した。すなわち、VDAC2, Timp3,　β-tubulin, lamin B, Chicitase ３であった。しかし、細胞表面分子は含まれておらず、レセプターの可能性は低いと考えられた。そのため、平成25年度においては、レトロウイルスライブラリーとパンニング法を用いて、Hsp90レセプター発現クローニングを行う。
2．レセプター媒介性エンドサイトーシスの共焦点顕微鏡による観察
Alexa４８８で標識したヒトHsp90を用いて、ヒトの樹状細胞によるエンドサイトーシスと細胞内局在を観察した。取り込まれたexHsp90は初期エンドソームに特異的にかつ長時間貯留（～3時間）を示した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成２４年度の計画における1. 細胞外Hsp90 (exHsp90)レセプターのクローニングについては、計画にあるcos細胞を用いた発現クローニングを行い得た。また2. レセプター媒介性エンドサイトーシスの共焦点顕微鏡による観察を行い、exHsp90の特徴的な初期エンドソームへの標的と長時間の貯留を示すことができた。以上のように、現在の達成度としては、おおむね順調に進展しているものと考えている。

今後の研究の推進方策

平成25年度においては、もう1つのストラテジーである、マウス未熟樹状細胞から作成したレトロウイルスライブラリーを用いて、パンニング法により、Hsp90レセプター発現クローニングを精力的に行い、レセプターをコードする遺伝子を同定する。具体的には、これらのcDNAライブラリーをマウスB細胞株P3U1の導入し、Hsp90を固層化したプレートを用いてパンニングを行い、結合したP3U1を回収し、cDNAライブラリー由来遺伝子をPCRを用いて増幅する。レセプターであるかの確認は、同定した遺伝子を哺乳類発現ベクターpcDNA3.1に組換え、293T細胞に発現させ、ビオチン化Hsp90の結合を検討することによって行う。同時にこの遺伝子のヒト樹状細胞における発現と相同性を確認し、ヒト樹状細胞においてもexHsp90のレセプターとして機能しているか、検討する。その後、このレセプターに対するリコンビナント蛋白質を作成し、マウスに免疫することにより抗Hsp90受容体抗体を作成する。この抗体を用いて、Hsp90のエンドサイトーシス阻害効果を確認する。またAlexa488ラベルHsp90を樹状細胞にパルスし、Hsp90-Hsp90レセプター複合体の動態を蛍光顕微鏡を用いて検討する。また平成26年度は、exHsp90をマウスに投与し、無菌性炎症モデルを作成し、同定したHsp90レセプターに対する抗体による治療効果を検討する。

次年度の研究費の使用計画

引き続き樹状細胞、大腸菌などの細胞培養に用いるサイトカイン、培養液、培養器具、遺伝子合成費用、Hsp90精製に用いる試薬類、免疫用のマウス購入費に必要とする。平成26年度には、樹状細胞などの培養に関わる費用、Hsp90精製に関わる試薬、培養器具等、マウス購入費に使用を計画している。

研究成果

• [雑誌論文] Immunotherapeutic benefit of α-interferon (IFNα) in survivin2B-derived peptide vaccination for advanced pancreatic cancer patients (2013)
  • 著者名/発表者名: Kameshima H, Tsuruma T, Kutomi G, Shima H, Iwayama Y, Kimura Y, Imamura M, Torigoe T, Takahashi A, Hirohashi Y, Tamura Y, Tsukahara T, Kanaseki T, Sato N, Hirata K.
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 104 ページ: 124-129
  • DOI: 10.1111/cas.12046
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heat-shock proteins as endogenous ligands building a bridge between innate and adaptive immunity. (2012)
  • 著者名/発表者名: Tamura Y, Torigoe T, Kukita K, Saito K, Okuya K, Kutomi G, Hirata K, Sato N.
  • 雑誌名: Immunotherapy 巻: 8 ページ: 841-852
  • DOI: 10.2217/imt.12.75
  • 査読あり
• [雑誌論文] New paradigm for intrinsic function of heat shock proteins as endogenous ligands in inflammation and innate immunity. (2012)
  • 著者名/発表者名: Tamura Y, Torigoe T, Kutomi G, Hirata K, Sato N.
  • 雑誌名: Curr Mol Med. 巻: 121 ページ: 1198-1206
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heat shock enhances the expression of cytotoxic granule proteins and augments the activities of tumor-associated antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Takahashi A, Torigoe T, Tamura Y, Kanaseki T, Tsukahara T, Sasaki Y, Kameshima H, Tsuruma T, Hirata K, Tokino T, Hirohashi Y, Sato N.
  • 雑誌名: Cell Stress Chaperones 巻: 17 ページ: 757-763
  • DOI: 10.1007/s12192-012-0348-0
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heat shock protein 40 family, DNAJB8 is expressed in renal cancer stem-like cell, controls the tumor-initiating ability and can be a potent target of immunotherapy. (2012)
  • 著者名/発表者名: Nishizawa, S., Mori, T., Hirohashi, Y., Torigoe, T., Tamura, Y., Kamiguchi, K., Takahashi, A., Kanaseki, T., Nakazawa, E., Asanuma, H., Sokolovskaya, A., Morita, R., and Sato, N.
  • 雑誌名: Cancer Res, 巻: 72 ページ: 2844-2854,
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-11-3062
  • 査読あり
• [学会発表] HSPs link the innate immunity and adaptive immunity (2012)
  • 著者名/発表者名: 田村 保明、鳥越 俊彦、佐藤 昇志
  • 学会等名: 日本癌学会
  • 発表場所: 札幌市
  • 年月日: 20120919-20120921
  • 招待講演
• [備考] 札幌医科大学病理学第1講座
  • URL: http://web.sapmed.ac.jp/patho1/