| 研究課題/領域番号 |
24659208
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
足立 昭夫 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 教授 (90127043)
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| 研究分担者 |
野間口 雅子 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 准教授 (80452647)
宮崎 恭行 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (70607233)
三宅 在子 徳島大学, ヘルスバイオサイエンス研究部, 助教 (20548622)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | ウイルス / HIV / Vpx / 拮抗因子 / 細胞因子 / 蛋白質翻訳 |
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| 研究概要 |
全てのヒト免疫不全ウイルス/サル免疫不全ウイルス（HIV/SIV）はアクセサリー蛋白質（Vif、Vpx、Vpr、Vpu及びNef）を持つ。アクセサリー蛋白質は宿主細胞に存在する様々な因子と相互作用することによりウイルスの複製・持続感染・伝播の最適化をもたらすと考えられている。ごく最近、Vpxとある種のSIV 由来Vprはミエロイド細胞（樹状細胞やマクロファージなど）中のSAMHD1やAPOBEC3Aを標的としこれを分解することが報告された。しかし、これらの細胞因子はミエロイド細胞に特異的に存在するわけではなく、リンパ球ではほとんど存在しない。Vpxはミエロイド細胞とリンパ球におけるHIV-2/SIVmacの複製に重要であることが遺伝学的解析から明らかにされているので、Vpxの標的細胞因子は他にも存在する可能性が高い。
本年度は、初代ヒト樹状細胞、ヒトマクロファージ様細胞株THP-1（未分化及び分化細胞）、H9（ヒトリンパ球細胞株）、293T（ヒト腎臓細胞株）、HSC-F（カニクイザルリンパ球細胞株）、M1.3S（アカゲザルリンパ球細胞株）、MK.P3(F)（カニクイザル腎臓細胞株）及びLLC-MK2（アカゲザル腎臓細胞株）を用いたマイクロアレー法によりVpxの標的細胞因子の候補を選択した。選択した15個の因子はpcDNA3.1(-)-cFLAGにクローンした。一過性のトランスフェクションでは、明確な結論が得られないことが判明したため、これらを一つ一つネコCRFK細胞に導入し恒常発現細胞株を取得した。現在、これらの細胞株につき、Vpx欠損ウイルスに対する抗ウイルス活性を検討中である。Vpx欠損ウイルスが増殖できない、あるいは、野生型ウイルスと比べ欠損ウイルスの増殖能が非常に劣る細胞株があれば、全く新しい抗HIV/SIV細胞因子が同定されることになる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の最終目標は、Vpxが標的とする新しい抗HIV/SIV宿主因子の同定である。本年度は、この目標に向け順調に研究が進展していると言える。
HIV/SIVが感染・増殖する様々な細胞系を解析に用いたため、候補細胞標的因子を15個に絞り込むことができた。当初は、候補因子を一過性に発現させた細胞とマーカー付HIV-2クローン（野生株及び変異体）とを用いたシングルサイクル感染性アッセイで抗ウイルス活性を検証することとしていた。しかし、このシステムでは、対照として用いたTRIM5蛋白質（非常に強い抗ウイルス活性を持つ細胞因子）でも明確な結果が得られないことがわかったため、検証システムを変更した。候補因子を恒常的に発現するネコCRFK細胞を樹立し、この細胞系を用いたシングルサイクル感染性アッセイで候補因子の抗ウイルス活性を検討することとした。恒常発現細胞株は極めて迅速に樹立されたので、研究に遅れはないと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、候補因子の恒常発現細胞の抗ウイルス活性の測定を継続し、有望な因子はsiRNAを用いた確認実験やバイオインフォマテックスなどによりVpxの標的細胞因子として同定する予定である。HIV-2/SIVmacとその変異体を用いたウイルス学的検証実験も当然行なわれる。さらに、Vpxとこの細胞因子の細胞内局在性も確認する。
候補因子はマイクロアレー法により15に絞られたが、抗HIV/SIV因子の同定の確率を向上させるため、cDNA発現サブトラクションライブラリーやプルダウンアッセイによる候補因子の探索も並行して行うこととしている。
Vpx拮抗因子が同定されれば、そのHIV-1複製に及ぼす影響も解析する。HIV-1はVpxを持たないが、構造や機能においてVpx のパラログとされるVprを持つ。ある種のSIV VprはVpxと同様に拮抗因子を分解するとの報告があるので、新しい抗ウイルス因子とHIV-1 Vprの相互作用の解析は大変重要な課題であると思われる。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
3月の納品を受け、4月に支払予定である。
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