膜蛋白質ｓｈｅｄｄｉｎｇの絶対定量解析基盤技術の確立と慢性炎症反応モニタリング

2013 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 24659280
• 研究機関: 愛媛大学
• 研究代表者: 東山 繁樹 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 教授 (60202272)
• キーワード: プロテオミクス / タンパク質絶対定量 / shedding定量 / 無細胞タンパク質合成 / 炎症マーカー

研究概要

コムギ胚芽を用いた無細胞タンパク質合成技術により作製した炎症関連マーカータンパク質候補（ケモカイン、サイトカインとそれらの受容体、免疫関連因子、プロテアーゼとそのインヒビター等、多数の膜タンパク質を含む２３８種）の質量分析により得られた、各タンパク質のイオン化ペプチド情報を基に、これらをタンデムに配列する人工タンパク質をコードする遺伝子を合成し、これを鋳型として人工タンパク質QCONCATを合成した。さらに本人工タンパク質QCONCATを内部標準タンパク質として使用する目的で、合成の際にN末端に独自に開発したTIPs (Tandem Internal standard Peptides)タグを付加し、TIPs タグを内部標準に用いて、合成タンパク質の絶対量を質量分析計で定量化することを可能とした。トリプル四重極型質量分析計（AB-SCIEX QTRAP5500）を用いて、TIPs タグ付き人工タンパク質QCONCATの質量分析をナノフローで再度行い、高感度＆ハイスループット性を検討した。その結果、良好なイオン化ペプチドシグナル強度を得ることができたものの、ナノフローの不安定性により再現性に乏しい結果となった。そこで、高感度＆ハイスループット性に劣るが、安定性のあるマイクロフローを採用し、再度検討した。その結果、10フェムトモルオーダーでの感度を再現できる良好な結果を得た。これを基に条件設定を行い、培養細胞系を用いた炎症関連マーカータンパク質のMultiple Reaction Monitoring (MRM)解析を現在進めている。

研究成果

• [雑誌論文] Cisplatin resistance by induction of aldo-keto reductase family 1 member C2 in human bladder cancer cells. (2014)
  • 著者名/発表者名: Shirato A, Kikugawa T, Miura N, Tanji N, Takemori N, Higashiyama S, Yokoyama M.
  • 雑誌名: Oncol Lett. 巻: 7 ページ: 674-678
  • 査読あり
• [雑誌論文] Annexin A2 regulates a disintegrin and metalloproteinase 17-mediated ectodomain shedding of pro-tumor necrosis factor-α in monocytes and colon epithelial cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto H, Tanida S, Ozeki K, Ebi M, Mizoshita T, Shimura T, Mori Y, Kataoka H, Kamiya T, Fukuda S, Higashiyama S, Joh T.
  • 雑誌名: Inflamm Bowel Dis. 巻: 19 ページ: 1365-1373
  • DOI: 10.1097/MIB.0b013e318281f43a.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Spatiotemporal visualization of proHB-EGF ectodomain shedding in living cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Inoue H, Sakaue T, Ozawa T, Higashiyama S.
  • 雑誌名: J Biochem. 巻: 154 ページ: 67-76
  • DOI: 10.1093/jb/mvt030. Epub 2013 Apr 18.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cisplatin influences acquisition of resistance to molecular-targeted agents through epithelial-mesenchymal transition-like changes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Kurokawa M, Ise N, Omi K, Goishi K, Higashiyama S.
  • 雑誌名: Cancer Sci. 巻: 104 ページ: 904-911
  • DOI: 10.1111/cas.12171.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Telmisartan inhibits cell proliferation by blocking nuclear translocation of ProHB-EGF C-terminal fragment in colon cancer cells. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ozeki K, Tanida S, Morimoto C, Inoue Y, Mizoshita T, Tsukamoto H, Shimura T, Kataoka H, Kamiya T, Nishiwaki E, Ishiguro H, Higashiyama S, Joh T.
  • 雑誌名: PLoS One. 巻: 8 ページ: e56770
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0056770.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Human antigen R-mediated mRNA stabilization is required for ultraviolet B-induced autoinduction of amphiregulin in keratinocytes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nakayama H, Fukuda S, Matsushita N, Nishida-Fukuda H, Inoue H, Shirakata Y, Hashimoto K, Higashiyama S.
  • 雑誌名: J Biol Chem. 巻: 288 ページ: 10338-10348
  • DOI: 10.1074/jbc.M112.417527.
  • 査読あり
• [学会発表] Ectodomain shedding制御とEGFR/Ligandシグナリング (2013)
  • 著者名/発表者名: 東山繁樹、福田信二
  • 学会等名: 日本病態プロテアーゼ学会
  • 発表場所: 大阪
  • 年月日: 20130816-20130817
  • 招待講演
• [学会発表] コムギ無細胞タンパク質合成系を用いた絶対定量プロテオーム解析技術の開発 (2013)
  • 著者名/発表者名: 武森信暁、武森文子、森下了、青島理人、澤崎達也、東山繁樹
  • 学会等名: 第65回日本細胞生物学会大会
  • 発表場所: 愛知
  • 年月日: 20130619-20130621
  • 招待講演
• [学会発表] Ectodomain shedding in EGFR/ligand signaling; regulation, functional implication and imaging (2013)
  • 著者名/発表者名: Shigeki Higashiyama
  • 学会等名: Matrix Metalloproteinases、Gordon Research Conferance
  • 発表場所: Lucca, Italy
  • 年月日: 20130519-20130524
  • 招待講演