|
本研究では細胞内小器官の生活反応を指標とした新たな法医診断法を開発するために、高分解能蛍光顕微鏡を用いた3次元画像解析により細胞内小器官の形態を可視化し、脳損傷の痕跡が生活反応としてミトコンドリアの形態に保存されているかについて検討した。
まず、高分解能蛍光顕微鏡を用いて高精細な細胞内小器官の3次元像を構築するために、画像取得条件の検討を行った。その結果、厚さ3～10 μmの脳組織免疫蛍光染色標本では均一な抗体の浸透を認め、退色による蛍光強度の低下や自家蛍光の影響は認められなかった。続いて、頭部外傷により引き起こされる脳細胞及びミトコンドリアの形態変化を調べるために、神経細胞、アストロサイト、ミクログリアのマーカー及びチトクロームc(ミトコンドリア蛋白質)に対する抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。その結果、神経細胞では、頭部外傷3時間後に細胞体の委縮が認められた。また、ミトコンドリアからのチトクロームcの漏出を認め、受傷後早期にアポトーシスが誘導されており、ミトコンドリアの形態が変化していると推察された。さらに、受傷48時間後に神経細胞の数が有意に減少していた。一方、グリア細胞（ミクログリア及びアストロサイト）では、受傷3時間後に細胞の明らかな肥厚を認め、受傷後時間経過に伴って細胞数が減少していた。そこで、ミトコンドリアの形態が、細胞の生活反応を反映しているかについて調べるために、培養細胞を用いて種々の固定条件で細胞死を誘導し、ミトコンドリアの形態を観察した。その結果、固定条件の変化に伴ってミトコンドリアの形態が変化していた。即ち、ミトコンドリアの形態は、細胞が死に至る過程を反映しており、死後の細胞においても保存されている可能性が示唆された。以上の結果から、高分解能蛍光顕微鏡を用いた3次元画像解析はミトコンドリアの生活反応を指標とした法医診断の開発に有用である事が分かった。
|
