| 研究課題/領域番号 |
24659337
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
石井 晃 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (30252175)
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| 研究分担者 |
服部 秀樹 愛知医科大学, 医学部, 准教授 (30107817)
小川 匡之 愛知医科大学, 医学部, 講師 (50559937)
財津 桂 名古屋大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (30700546)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| キーワード | 質量分析 / 胆汁酸 / タンデム質量分析 / 高速液体クロマトグラフィー / 抱合体 |
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| 研究実績の概要 |
昨年度は、これまでに開発した胆汁酸測定系を用い、高血圧易発症性高血圧自然発症ラットの亜系であるSHRSP5/Dmcrラットにおける高脂肪食投与時の胆汁酸動態の検討を行ったところ、一部の胆汁酸の組成が変化することが示され、従来法の有効性が示された。しかし、胆汁酸は種差が大きく、光学異性体も含む類似化合物も多数存在することや、各化合物のより詳細な検討の必要性も明らかとなった。従来法は、短時間で多数の胆汁酸を検出できる利点が存在したが、スループットネスを犠牲にしても、より微量のサンプルで多種類の胆汁酸を分析できる方法の開発が求められた。
従って、本年度は、より高感度で多数の胆汁酸が分離できる系の構築を試みた。質量分析計は、更なる高感度が期待できるAB Sciex社の4000QTRAP質量分析計を用いることとした。また、硫酸抱合体の挙動を追跡するため、対象化合物を９種類追加し、定量性を高める為に内部標準も３種類追加した。また、上述したように、胆汁酸は極めて類似した構造をもち、化学的挙動も似ているものが多いため、nanoLCを採用し、移動相の有機溶媒をメタノールにして、グラジエントもより緩やかなものを採用した。メタノール10 %から40分で100 %まで上昇させるプログラムを採用することにより、20～45分の間に各種胆汁酸が分離でき、良好な分離を得ることができた。また、nanoLCを使用することにより、従来法の感度と比較して、数倍良好な感度が得られたにも関わらず、適切なフィルトレーションにより、LCの不具合は認められず、スケールダウンが可能であることも示された。また、従来法ではプレーカーサーイオンとプロダクトイオンが同一のものが多かったが、今回は、コリジョンチャンバー内で分解する分子種が多く、現在の方法の有用性がいくつか明らかとなり、これらを生かした分析を行なう予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在、分離に関しては概ね条件が確立したと考えられる。上述したように、胆汁酸は構造が類似し、化学的挙動も著しく類似したものが多数存在するため。短時間で分析が可能な分析法と、良好に分離する分析法を両立させることは極めて困難と言える。今回、従来法よりも多種類の胆汁酸を分析する必要性が明らかとなり、微細な分離条件の調節が必要であったことを考慮すると、本年度の進展は、概ね順調と評価してもよいと考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、感度限界の検討、定量性に関し、標準血漿への添加試料での検討を行なった後、モデル動物の血漿、肝臓の実試料での測定を試み、validationが確立した後に、まず、高脂肪食投与ラットでの測定を行なう予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
平成２６年度より、胆汁酸分析のミクロ化を含む条件検討を再度行い、その結果をふくめてヒトの胆汁酸分析を施行する予定であった。一方、内部標準の追加等でより再現性の高い分析の可能性が出てきたため、計画を変更し、内部標準間での測定値の比較を行ない、最適な内部標準を選択するよう、方針を一部転換したため、胆汁酸の分析の消耗品に次年度使用額が生じた。
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| 次年度使用額の使用計画 |
上述の研究計画の軽微な変更に伴い、胆汁酸のnanoLC-MS-MSを用いた分析法の確立と学会発表は次年度に行なうこととし、未使用額は、カラム等の消耗費や旅費等の経費に充てることとする予定である。
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