研究課題
挑戦的萌芽研究
Moderate-cold-shockやUV、hypoxiaで発現が誘導されるRBP、CIRPとRBM3はマウスのprimary cellの不死化とtransformationを誘導し癌遺伝子として機能する。ヒト癌でCIRPとRBM3は発現が亢進する。HepG2のtranscriptome全体からCIRPやRBM3に結合するtranscriptsを同定するために、biotin-streptavidin-based crosslinking and immunoprecipitation(CLIP) procedureを今回は使った。Tobacco Etch Virus endopeptidase cleavage siteの前にbiotin-ligase recognition site(BRS)を持ったCIRPあるいはRBM3蛋白質をBRS-CIRP (or RBM3)をビオチン化するバクテリアのBirA biotin ligaseと共にHepG2細胞株にstablyに共発現させた細胞クローンを得た。UVによってcrosslinkしたCIRPあるいはRBM3と相互作用するRNAsをstreptavidin上でsequenceするために、精製した。N端あるいはC端にBRSをつけたCIRPあるいはRBM3をstablyに発現させたクローンを使った２つの独立したCLIP-seq実験から高度に類似したシークエンスのデータセットを得た。転写物中にCIRPあるいはRBM3tと相互作用する部位を同定するために、CLIP-signalに対して転写の位置特異的な最低限の閾値をもうけて、局所的にenrichされたCLIP-sequences(clusters)を探すアルゴリズムを拡張した。
3: やや遅れている
RNA-binding-protein(RBP)、CIRPとRBM3のtranscriptome内でのRNA結合部位の同定はsequencesのdatasetsとして得るところまでは終了した。3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal-regulationのハブの役目を負っていると考えられるので、HEH293のArgonauteタンパクのPAR-CLIPのdataと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較することを行う予定である。3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにある保存されたmiRNA-target-sites(miRNA-seeds)をPicTarあるいはTargetScanSによって、予測することを来年度に行う予定である。CIRPやRBM3の結合のpreferenceを調べるために、41-ntの中央付近の7-ntの出現頻度をPAR-CLIP法で解析する。この結果はin-vitro-protein-binding-microarray-assayで解析されたin-vitro-CIRP-binding-sites、in-vitro-RBM3-binding-motifsと一致するかどうかを検討する予定である。RNAのsecondary-structureはRBPsの結合の特異性に相関している。CIRPやRBM3の3’-UTR付近の結合配列がhairpin-loopを形成するかどうかをcomputerでfoldさせて、Base-pairing-probabilitiesを平均化して、CIRPやRBM3のanchor部位の近傍のpairing-probabilitiesが大きいのか、小さいのかを計算する。Hairpin-loopが形成されるかどうかも予測する予定である。
3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal-regulationのハブの役目を負っていると考えられるので、HEH293のArgonauteタンパクのPAR-CLIPのdataと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較する。3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにある保存されたmiRNA-target-sites(miRNA-seeds)をPicTarあるいはTargetScanSによって、予測する。CIRPやRBM3がHuRと同じようにmRNA-stabilization-effectを3’-UTRのARE-sequenceに結合するような機序を介していくつかのmRNAを安定化しているかどうかを解析する。CIRPやRBM3のタンパク合成に対する影響を調べる。pulsedSILAC(pSILAC)-proteomics-measurementsという方法で測定する。CIRPやRBM3は3’-UTRだけではなくintronsにも好んで結合している可能性がある。我々の得たｍRNA-sequencing-dataをCIRPやRBM3に依存したalternative-splicingをもつ遺伝子についてスクリーニングする。RBPs、CIRPやRBM3がそのmiRNA-processingに関与しているmiRNAを同定する。miRNA-CIRP-interplayあるいはmiRNA-RBM3-interplayによって影響を受けるmiRNAをPAR-CLIPのシークエンスデータとmiRNA-seedsのシークエンスデータを比較することで見つけ出す。RBPｓがknockdownした場合、HepG2のphenotypeはどのように変化するか検討する。
該当なし。
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