研究課題
ヒト癌でRNA結合蛋白CIRPとRBM3は発現が亢進。moderate cold shock（〜32℃）や紫外線、低酸素で発現が誘導されるCIRPとRBM3はmurine primary cellの不死化とtransformationを誘導し癌遺伝子として機能。CIRPはマウスの時計遺伝子をposttranscriptionallyに調節する。CIRPは細胞外に分泌されて、敗血症や大量出血後の炎症反応を促進。HepG2のtranscriptome全体からCIRPやRBM3に結合するtranscriptsを同定。biotin streptavidin based crosslinking and immunoprecipitation(CLIP)。TEV endopeptidase cleavage siteの前にbiotin ligase recognition site(BRS)を持ったCIRPあるいはRBM3を発現するvectorとBRSをビオチン化するバクテリアBirA biotin ligaseを発現するvectorを共にHepG2細胞株にstablyに発現。CIRPやRBM3と結合するRNAsはbiotinとstreptoavidinの強固な結合により、UV crosslink後、streptavidinにて精製。精製RNAsは別のvectorにligateされ、次世代シークエンサーで塩基配列を決定。N端あるいはC端にBRSをつけたCIRPあるいはRBM3をs発現させたクローンを使った２つの独立したCLIP seq実験からシークエンスのデータセットを得た。転写物中にCIRPあるいはRBM3と相互作用する部位を同定。CLIP signalに対して転写の位置特異的な最低限の閾値をもうけて局所的にenrichされたCLIP sequencesを探すアルゴリズム。CIRPに結合するRNAsの中にがん抑制遺伝子であるBRCA1、BRCA2。BRCA1、BRCA2 は細胞のDNA damage後のhomologous recombinationに関与する。細胞のDNA damage (cis-platinによる)後のcolony formation assayではDNA damage 時に細胞を32℃に置くことにより、37℃の場合に比較して、homologous recombinationによるDNA repairが促進。このメカニズムにCIRPのBRCA RNAに対するposttranscriptionallyな調節機構が関与。
2: おおむね順調に進展している
RBPであるCIRPとRBM3のtranscriptome内でのRNA結合部位はsequencesのdatasetsとして得た。3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal regulationのハブであるので、HepG2のArgonauteのPAR-CLIPのsequence datasetsと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較。3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにあるmiRNA target sitesをPicTar、TargetScanSによって予測。CIRPやRBM3の結合のpreferenceを調べるために41-ntの中央付近の7-ntの出現頻度をPAR-CLIP法で解析。in vitro protein binding microarray assayで解析された binding sitesと一致するかどうかを検討。ある程度の一致。RNAのsecondary-structureはRBPsの結合の特異性に相関。CIRPやRBM3の3’-UTR付近の結合配列がhairpin loopを形成するかどうかをcomputerでfoldさせて、Base pairing probabilitiesを平均化して、CIRPやRBM3のanchor部位の近傍のpairing probabilitiesを計算。Hairpin-loopの予測。CIRP RBPはがん抑制遺伝子BRCA1 、BRCA2に3’-UTRを介して結合。BRCA1、BRCA2に対するmiRNAsに対してもCIRPは結合。BRCA1、BRCA2に対するmiRNAに結合により安定化。
3’-UTRは遺伝子発現のposttranscriptinal regulationのハブなので、ArgonauteのPAR-CLIPのdataと3’-UTR付近のCIRP、RBM3結合部位をcomputerで比較、3’-UTRでのCIRPやRBM3のanchor部位の近くにあるmiRNA target sitesをPicTa、TargetScanSによって予測。CIRPはBRCA1、BRCA2の3’-UTRに結合、BRCA1、BRCA2のmiRNAsにも結合。他のDNA damage responseに関与した分子の3’-UTR、miRNAがCIRPあるいはRBM3への結合の有無。CIRPやRBM3がHuRのようにmRNA stabilization effectを3’-UTRのARE sequenceに結合する機序を介してmRNAを安定化。BRCA1、BRCA2について。CIRPやRBM3のタンパク合成に対する影響を調べる。pulsed SILAC proteomics measurements。CIRPやRBM3はintronsにも結合。RNA sequencing dataからCIRPやRBM3に依存したalternative splicingをもつ遺伝子の探索。CIRPやRBM3がそのmiRNA processingに関与しているmiRNAを同定。miRNA CIRP interplayあるいはmiRNA RBM3 interplayによって影響を受けるmiRNAをPAR-CLIPのデータとmiRNA seedsのデータを比較。CIRPがBRCA1、BRCA2 miRNAsに結合することによる影響。RBPｓがknockdownした場合、HepG2のphenotypeの変化。CIRPがoverexpress、あるいはknockdownされた場合、他のhomologous recombinationに関与する遺伝子の発現への影響。non-homologous recombinationに関与する遺伝子の発現量の変化。Direct repeat recombinationをassayするU-2OS DR-GFPを作製する。Homologous recombinationへの32℃、CIRP、RBM3、BRCA1、BRCA2の関与。
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