研究課題
本研究の目的は、申請者が、血管障害モデルマウスの障害血管新生内膜や動脈硬化病変において発現亢進していることを見出した、rho依存性SRF転写共役因子myocardin-related transcription factor (MRTF)-Aの病的血管リモデリングにおける役割と、その発現および機能制御機構、更には血管病に対する新規治療標的としての意義を明らかにすることである。本年度は以下のような研究を行った。１、血管障害モデル動物を用いたMRTF-Aの病的血管リモデリングにおける役割の解析。MRTF-Aノックアウトマウス(KO)において種々の血管障害モデルを作製し、その解析を行った。具体的にはMRTF-AKOにおける頚動脈縮策モデルおよび大腿動脈内皮ワイアー障害モデルを作製し、MRTF-A+/+マウスの血管病変と比較検討した。その結果、MRTF-A KOでは血管病変の進展が抑制されていることを見出した。２、動脈硬化モデルマウスを用いたMRTF-Aの病的血管リモデリングにおける役割の解析。上記血管障害モデルに加えて、動脈硬化性血管病変モデルマウスであるApoEノックアウトマウスとMRTF-Aノックアウトマウスとの掛け合わせを行い、MRTF-A-/-;ApoE-/-マウスを作製し解析した。その結果、MRTF-A-/-;ApoE-/-マウスにおいて、動脈硬化性病変がMRTF-A+/+;ApoE-/-マウスより減弱している結果を得た。3、培養平滑筋細胞を用いたMRTF-Aの病的血管リモデリングにおける役割の解析。培養血管平滑筋細胞を用いて、siRNAによるMRTF-Aノックダウンをおこない、遊走能、増殖能の検討を行ったところ、MRTF-Aをノックダウンした血管平滑筋細胞では有意に増殖能及び遊走能の低下を認めた。これらのことは血管病進展におけるMRTF-Aの役割を示唆する。
2: おおむね順調に進展している
申請時の本年度の計画として、１、血管障害モデル動物を用いたMRTF-Aの病的血管リモデリングにおける役割の解析、２、動脈硬化モデルマウスを用いたMRTF-Aの病的血管リモデリングにおける役割の解析、3、培養平滑筋細胞を用いたMRTF-Aの病的血管リモデリングにおける役割の解析を上げた。１，２に関しては上記研究実績の概要に記したように、予定通りに血管病変モデルを作製、解析し、MRTF-A KOでは複数の血管病モデルにおいて、その病態進展が抑制されていることを見出し、MRTF-Aの血管病進展における意義を確認した。3に関しては、MRTF-Aをノックダウンした培養平滑筋細胞を用いて、MRTF-Aが血管平滑筋細胞の増殖や遊走にSRF標的遺伝子発現調節を介して重要な役割を果たしていることを見出した。またMRTF-Aの血管平滑筋における発現調節機序に関しては、MRTF-Aの5'FRを用いて解析したが、有意な所見を認めなかったことから、現在、5'FR以外の部分による調節の検討を行っている。特に3'UTRにmiR-1標的シークエンスを見出し、miR-1におけるMRTF-Aの発現調節機序に注目し、その関与を明らかにしている。以上のようにほぼ本年度は予定通りの研究進捗であると考えている。
来年度の研究計画は、以下のように、申請時の計画にほぼ沿った形で進める予定である。１、MRTF-A発現亢進におけるmicroRNA-1の関与とその分子機構の解明。上述したように、申請者はMRTF-A発現亢進機序の少なくとも一部にMRTF-A遺伝子の3'UTRに存在するmiR-1標的シークエンスを介したmiR-1による発現抑制の解除が関与する可能性を見出している。培養平滑筋細胞を用いてmiR-1の関与に関してさらに詳細に解析を行う。２、病的血管平滑筋におけるmyocardin発現低下の分子機構の解明。申請者は血管病変における脱分化型血管平滑筋細胞でmyocardinの発現が減少することがmiR-1発現減少、更にはMRTF-A発現亢進につながると考えているが、myocardinが脱分化型血管平滑筋細胞で発現低下する機序は未だ明らかでない。そこで、myocardinのpromoter-enhancer部位をクローニングし、luciferaseおよびlacZ遺伝子の上流に挿入したレポーター遺伝子を作製し、血管平滑筋細胞およびin vivoにおいてその発現解析を行い、脱分化型血管平滑筋細胞における発現低下に関与する転写制御領域に関する解析を行う。３、MRTF-A阻害薬を用いたMRTF-Aの新規血管病治療薬としての意義の検討平成24年度の研究においてMRTF-A亢進の病的血管リモデリングにおける役割が明らかとなったことから、さらに最近同定されたMRTF-Aを阻害する低分子化合物CCG-1423を前述の複数種類の血管病変モデルマウスに投与し、その効果を検討する。
本研究では研究代表者が大学院生を指導しつつ、MRTF-AやApoEノックアウトマウスなど複数の遺伝子改変動物や大腿動脈ワイアー障害、頸動脈結紮などのインターベンションによる血管障害モデルマウスを作製、使用し、その組織学的、生理学的、分子生物学的、生化学的解析を行う必要がある。そのため多数のマウスの飼育が必須であり(継代・維持を含め計80ケージくらいと概算している)、それらマウスの作製・維持・管理に研究費を使用する（当該費用は消耗品費、一部管理のために生ずる賃料等に関してはその他に計上）。またこれらマウスの解析に使用する器具(消耗品)の購入にも使用する。また資料収集・成果発表のための学会出張の旅費にも一部使用する。本研究はほとんどすべて京都大学大学院医学研究科にておこなうため、その遂行のための設備はほとんどそろっており、新規高額研究機器の購入は予定していない。
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