| 研究課題/領域番号 |
24659413
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
佐々木 成 東京医科歯科大学, 医歯(薬)学総合研究科, 教授 (60170677)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | アクアポリン / 嚢胞腎 / 小胞体 / トランスジェニックマウス / 免疫染色 |
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| 研究概要 |
細胞形質膜に存在し水/イオン/小分子を経上皮的に輸送する輸送体蛋白に比べ、小胞体などの細胞内膜系に存在する輸送体は、その研究手法が限られてきたことからその研究は遅れている。しかしながらヒトの病態と深く関わる事も明らかになってきており、その研究の進展は急務である。本研究では、我々が扱ってきたAQP水チャネルのうち、主として小胞体に存在し、その欠損がヒトの病態モデルとなる事が判明したチャネルについて、それらのオルガネラ機能への関与を探り、その破綻がオルガネラ/細胞/臓器機能に与える病態を解明する事を目的とする。
まず24年度は、作成に成功した3xHAタグ付きAQP11BACトランスジェニックマウスの解析をおこなった。タグ付きにした理由は、今までにnativeのAQP11に対して良好な抗体が得られなかったためである。BACトランスジェニックマウスであるので、遺伝子全長を導入しており、その発現臓器は生理的な発現臓器と同じであると考えられるが、PCRにて内因性の発現と、タグの部位を認識するプライマーでトランスジーン由来の発現に差があるかどうかを検討した結果、タグ付きAQP11は内因性のAQP11と発現臓器が変わらないことを確認した。また、機能的にもこの3xHA-AQP11が生体内で機能しているかを検証するため、すでに我々が作成したAQP11ノックアウトマウスと交配し、その異常（嚢胞腎を発症）を相補できるかを検証し、相補を確認した。
よって、このタグ付きAQP11は生理的な内因性のAQP11と同じ機能を有していると結論し、このトランスジェニックマウスを用いて、腎臓でのAQP11蛋白の存在部位を免疫染色の同定を試みた。その結果、腎臓内ではAQP11はERのマーカーと共発現していることが確認された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
研究計画に記したように、タグ付きAQP11トランスジェニックマウスの作成に成功し、AQP11の生体内での存在部位が小胞体である事を確認することができた。また、このタグ付きAQP11をプルダウンして、それに結合してくる蛋白を質量分析により網羅的に解析中である。既に、いくつか候補蛋白が得られている。このタグ付きAQP11トランスジェニックマウス作成のコンストラクトを改変し、すでにもつAQP11KOマウスを利用してinducibleなAQP11KOマウスのシステムの構築も既に完了している。
以上により、研究計画は当初の予定通りに進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
24年度の検討で、AQP11がAQP12と同様に小胞体の水チャネルであることが確定できたので、今後は、小胞体の機能におけるAQP11/12の役割を確定する研究に重点をおいて研究を推進する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
今後は、inducibleなAQP11KOマウスを確立し今後の解析に利用できるようにする事を推進しつつ、今現在あるコンベンショナルなAQP11/12KOマウスを利用して、腎臓ないし膵臓由来の初代培養細胞を確立し、小胞体でのCa放出機構に対するこれらAQP11/12ノックアウトの影響を明らかにする。嚢胞腎の形成機構として、小胞体からのCa放出の異常が報告されており、また膵腺房細胞からの膵酵素の放出のトリガーは細胞内Ca上昇であることも考えると、まずは一般的な細胞内Caイメージングにより、小胞体からのCa放出へのAQP11/12欠損の影響を検討する。また、Caイメージング以外にも、ERストレスへの反応性の変化についても検討を加える。
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