| 研究課題/領域番号 |
24659438
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| 研究機関 | 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター |
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研究代表者 |
永井 義隆 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター, 神経研究所疾病研究第四部, 室長 (60335354)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | 遺伝子 / 神経科学 / 蛋白質 / 脳神経疾患 / RNA |
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| 研究概要 |
近年、筋萎縮性側索硬化症（ALS）はTDP-43/FUSなどRNA結合蛋白質の凝集・蓄積、核内からの消失により発症すると考えられるようになったが、ごく最近RNA 内のGGGGCCリピート配列の異常伸長が多くのALSの原因遺伝子異常として発見された。本研究ではALSの発症メカニズムとして、遺伝子異常あるいはRNAストレスなどによるRNAの異常蓄積がRNA結合蛋白質の凝集・蓄積を引き起こして神経毒性を獲得するという仮説に基づき、１）異常伸長GGGGCCリピートを発現する新規ALSモデルショウジョウバエを樹立、その病態メカニズムを解明し、さらに病態への２）TDP-43/FUSの関与を調べ、あるいは３）RNAストレスがGGGGCCリピートRNAおよびTDP-43/FUSへ及ぼす影響を明らかにすることで、ALSの発症分子メカニズム解明を目指す。上記目的達成のため、今年度は以下の研究を行った。
１）異常伸長GGGGCCリピートを発現するALSモデルショウジョウバエの樹立とその病態解析
まず、GGGGCCリピート配列の野生型（9リピート）もしくは異常伸長（50リピート、100リピート）をショウジョウバエ用pUASTベクターに挿入し、ショウジョウバエ胚にマイクロインジェクションにより導入して、トランスジェニックショウジョウバエを作製した。そして、GGGGCCリピートを含むRNAを神経系に発現させたところ、異常伸長リピートでは発生段階での致死を呈した。次に複眼で発現させたところ、異常伸長リピートでは顕著な複眼変性を生じることが明らかとなった。一方、野生型GGGGCCリピートの発現ではこれらの症状は生じなかった。以上のことから、異常伸長したGGGGCCリピートRNAはin vivoにおいて神経毒性を発揮することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
異常伸長GGGGCCリピートは、GC含有率が高くかつリピートが長いためにPCRなどの分子生物学的操作が非常に困難であるが、合成DNAを連結することにより異常身長GGGGCCリピートの作製に成功し、さらにin vivoにおいても異常身長GGGGCCリピートが維持された世界初の新規ALSモデルトランスジェニックショウジョウバエの樹立に成功した。そして、異常伸長GGGGCCリピートがin vivoにおいて神経変性を惹き起こすことを世界で初めて明らかにした。特に、本研究計画の中で一番の懸念事項であったGGGGCCリピートRNAの神経毒性を見出すことに成功したことから、当初の計画以上に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、前年度に樹立に成功したGGGGCCリピート発現新規ALSモデルショウジョウバエについて、GGGGCCリピートRNAの発現量をRT-PCRにて、GGGGCCリピート長をRepeat Primed PCRにて確認する。そして、in situハイブリダイゼーションおよび免疫染色にて、神経細胞内のRNA蓄積およびRNA結合蛋白質などの蓄積の有無を明らかにする。一方、神経系での異常伸長GGGGCCリピートRNAの発現では、発生段階で致死に至り成虫における進行性の神経症状などの解析を行うことができなかったため、今後、薬剤依存的に異常伸長GGGGCCリピートRNAを発現するコンディショナルモデルを樹立し神経症状の解析を行う。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
トランスジェニックショウジョウバエの購入および作製。
免疫染色などに必要な抗体の購入および作製。
in situハイブリダイゼーションに使用するプローブの購入および作製。
ショウジョウバエの飼育／維持費。
必要に応じて飼育用インキュベーターの購入。
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