研究課題
がん幹細胞とは、自己複製能力と未分化性の維持能力を新たに獲得した悪性の幹細胞であり、腫瘍の源である。難治性悪性腫瘍の治療成績の向上には、がん幹細胞自身を標的とした新規治療法の開発が求められている。がん幹細胞を標的とする治療法の開発には、１）がん幹細胞の純化、２）その純化したがん幹細胞の生体内での機能、を知る必要がある。これらを明らかにするために必須の基本技術が、高度免疫不全マウスを用いた異種移植アッセイシステムである。本課題では、高効率な癌幹細胞アッセイのための次世代異種移植モデルを確立する。我々は、繁殖能力の高いC57/BL6ストレインに、Rag2欠損、Il2rg欠損によってマウスT細胞分化を完全遮断し、ヒト型SIRPA遺伝子をノックインし、完全ヒトCD47-ヒトSIRPA結合可能による完全マクロファージ寛容を導入したマウスラインを目指す。我々は、すでに、B6バックグランドでRag2およびIL2Rγを欠損したマウスに、NOD型SIRPA変異を導入した免疫不全マウスB6.Rag2(null)Il2rg(nul)lSIRPA(NOD/NOD)ライン(BRGS)を樹立し、現存するラインで最高の生着効率を持つNOG/NSGラインと同等の生着効率を持つこと明らかにし、Blood誌に報告した。この結果は、マクロファージ寛容の強化によって、マウスバックグラウンドによらず、新規免疫不全マウスラインの樹立が可能であることを示している。さらに、完全マクロファージ寛容導入を目的としてヒト型SIRPAをノックインしたラインの樹立した。このラインをBRGSラインと交配し、最終マウスラインの樹立を行った。現在、新型マウスラインのヒト細胞の生着効率を検証中である。
2: おおむね順調に進展している
本課題では、高効率な癌幹細胞アッセイのための次世代異種移植モデルを確立する。我々は、繁殖能力の高いC57/BL6ストレインに、Rag2欠損、Il2rg欠損によってマウスT細胞分化を完全遮断し、ヒト型SIRPA遺伝子をノックインし、完全ヒトCD47-ヒトSIRPA結合可能による完全マクロファージ寛容を導入したマウスラインBRGhSを樹立した。このBRGhSマウスにおいては、T細胞のリークがなく、ヒト型SIRPを持つために、マクロファージの貪食による移植片拒絶を回避可能で、NOD型SIRPAをもつBRGSラインと比べても良好なヒト造血細胞生着がみられることが予想される。当該年度では、ヒト型SIRPAノックインライン最終ラインが得られているが、ラインの維持や今後の実験のためには、マウスコロニーの拡大、安定が必須であり、現在、交配を繰り返している。同時に、現在は、ヒト正常造血幹細胞分画を移植し、ヒト細胞の生着能を検証中である。さらに、その後は、各種がん幹細胞のアッセイ系の開始を予定している。最終ラインが得られ、マウスコロニーは順調に拡大しており、研究計画はおおむね順調に進展している。
新規ラインの確立、バッククロスなど作製には時間がかかるため、次年度以降もも引き続いてラインの確立を継続する｡実験には多数のマウスが必要であり、マウスコロニーの拡大、凍結杯の保存などに、時間を要することが予想される。マウスコロニーの拡大後、各種がん幹細胞アッセイ系の至適化を試みる。現在の固形がんの異種移植アッセイでは、分離した幹細胞分画は、皮下投与で移植されるが、生着効率が低く、詳細な幹細胞分画の同定が困難であった、本課題で樹立するマウスラインでは、ヒト移植片に対して完全なマクロファージ寛容が成立しており、幹細胞分画を皮下投与しても、マウス皮下に存在するマクロファージによって拒絶されることなく、高効率な生着が期待できる｡造血器腫瘍のほか、大腸がん、乳がんなど広く悪性腫瘍組織よりFACS Aria SORPを用いて高純度に分離した細胞分画を、静注、骨髄内、新生仔マウス顔面静脈、皮下などの投与経路で移植し、マウスでの腫瘍再構築能を検証し、至適移植法の確立ととともに固形がんにおける幹細胞分画の高度純化を目指す｡
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