| 研究概要 |
国内のおけるC 型肝炎ウイルス（HCV）感染者は約200 万人とされ、その多くが慢性肝炎から肝硬変、肝細胞癌へと移行する。これまでHCV の感染、複製、粒子形成に関わる宿主遺伝子は数多く報告されているが、いまだその全容は明らかになっていない。そこで、本研究では、新規遺伝子発現抑制法shRNAmirを用いて35,000の宿主遺伝子の発現がひとつずつ抑制された肝細胞癌由来細胞株Huh7.5.1にマーカー遺伝子(TK, Gluc)を発現するHCVを感染させることにより、HCVの生活環に必須な遺伝子を網羅的にスクリーニングし、同定した遺伝子の機能解析および新規HCV治療薬のターゲットの創出を目指す。
前年度は、HCV感染・複製・粒子形成に関連する遺伝子の網羅的同定に必要なヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV-TK)と分泌型ルシフェラーゼ(Gluc)を発現するHCVサブゲノムレプリコンRNAを発現するベクターを構築した。構築したベクターにzeocin耐性遺伝子を挿入し、Huh7.5.1に遺伝子導入・薬剤選抜することで、安定発現細胞株を樹立した。樹立した細胞株でTKが高発現していることを免疫染色法、Glucが高発現していることをLuc assay、HCV RNAが発現していることをリアルタイムPCR法により確認した。本年度は、これらのマーカー遺伝子を発現する一過性感染HCVウイルス(HCVtcp)を産生するために、エピソーマルに複製可能なプラスミドにHCV構造遺伝子Core-NS2領域を挿入したベクターを構築、遺伝子導入することで、網羅的スクリーニングに必要となる細胞株、HCVtcpを得ることができた。現在、これら樹立したHCVサブゲノムレプリコンRNA安定発現細胞株に35,000種のヒト遺伝子を抑制できるshRNAmir発現組換え体レンチウイルスを感染させ、HCV感染・複製、粒子形成能が欠損した細胞株の単離を行っている。得られた候補遺伝子について、今後、遺伝子の発現抑制、過剰発現によるHCV生活環への影響、作用機序を明らかにする。
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