| 研究課題/領域番号 |
24659502
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 京都府立医科大学 |
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研究代表者 |
周藤 文明 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 研究員 (20271166)
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| 研究分担者 |
日高 京子 北九州市立大学, 公私立大学の部局等, 教授 (00216681)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
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| キーワード | HCN4 channel |
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| 研究概要 |
我々の研究は、ウイルスを用いた遺伝子導入(高い発癌リスク)なしに、ES幹細胞から作った心筋細胞から、刺激伝導系心筋細胞に特異的に発現するHCN4（Hyperpolarization Activated Cyclic Nucleotide-Gated Potassium channel 4）をマーカーとして、高度に分化した心筋細胞（刺激伝導系細胞）を分離誘導する事を目的としている。心筋細胞を生きた状態で分離誘導するため、HCN4の細胞表面エピトープに結合でき得る「複数」の抗体を考案（n=4）、作製(n=2)した。
本研究では、最終的には、共同研究者がすでに確立している心筋細胞から、刺激伝導系心筋細胞を分離させることを目標とするが、その心筋細胞の作製には時間と人手を要するので、その前に、抗体の有用性を十分に確認する必要が有る。
現在、その確認作業を行っている。作製した2つの抗体のうち、より効率的にHCN4の細胞表面エピトープに結合出来る抗体を選別するための作業を進めている。具体的には、HCN4 を強制発現させたCHO細胞とコントロールのCHO細胞に対し、我々の2つの抗体と、すでに市販されているHCN4 抗体を反応させ、ウエスタンブロット（WB）法で定量的に比較し、免疫組織分析で我々の細胞表面への結合を確認する。現在、まずは手技的に慣れているWB法での比較を開始したところであり、夏までに、WB法による分析は終了する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
現在のペースであれば、夏までに、我々の作った抗体の有用性は確認できるものと考えられる。抗体の有用性が確認できれば、心筋細胞の作製は、分担研究者により十分に確立されているので、心筋細胞からの刺激伝導系心筋細胞の分離の試みは、数か月の以内に実行可能であると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
我々の抗体の有用性が確認された後は、市販のHCN4抗体(入手済み)を用いWB法により、分担研究者により作製される心筋細胞におけるHCN4発現を確認した後、この心筋細胞からの刺激伝導系細胞の分離誘導を行う。
刺激伝導系細胞の分離が困難な場合、その主要な原因は１）分担者による心筋細胞におけるHCN4発現が不十分である場合、２）抗体がこの心筋細胞からの刺激伝導系細胞の分離誘導を行うのに十分な機能を果たさない場合、が考えられる。
１）の場合、iPS細胞から誘導した心筋細胞の提供を複数の研究者から申し出を受けている。また、動物心臓から酵素的に心筋を分離する事も可能で、研究代表者は動物からの心筋単離には精通している。
２）の場合、考案済みで未作製の抗体が３つあるので、それらを使用する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
最初に作成した抗体（抗体＃1)のHCN4チャンネル強制発現細胞への結合を蛍光抗体法で確認する作業を行ったが、結合は確認されなかったので、上記の考案済みで未作製の抗体３つ(＃2、＃3、＃４)を作製し(約360千円)、これらの抗体の機能確認を行った後、分担研究者により作製される心筋細胞におけるHCN4チャンネルの発現を確認し、抗体＃２～４を用い、刺激伝導系細胞の分離誘導を行う。
1030千円の使用計画は物品費780千円、人件費0千円、旅費250千円、
次年度の研究費1700千円の使用計画は物品費1200千円、人件費300千円、旅費200千円、となる。
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