研究課題
昨年度に引き続き、MBII-52 snoRNA部位ターゲティングベクターをマウスES細胞に導入し、標的相同組換えによる変異受容細胞（アクセプター細胞）の取得を目指した。標的とするゲノムDNA領域が約100kbと長大であり、単一のターゲティングベクターを用いた一般的な手法では組換えが困難であったため、ターゲティングベクターの設計を変更した。標的部位の上流側および下流側で個別に標的組換えを施すため、ネオマイシン耐性遺伝子をもつ上流側用ターゲティングベクターおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を含む下流側用ターゲティングベクターを構築した。標的組換えの工程では、マウスES細胞に上記2種のベクターを共導入し，2種の抗生物質に耐性をもつ細胞クローンを複数単離した。得られたクローンについて、PCRおよびサザンブロット解析により選別を行ったが、期待される組換えをもつクローンは得られなかった。現在、2種のベクターを順次導入する方法を試みている。一方、アクセプター細胞が得られた後にMBII-52遺伝子に変異導入するための変異カセットの構築のため、MBII-52遺伝子クラスターを含むBACクローンから15および30個の遺伝子を欠失した変異遺伝子の作製をPCRにより試みた。しかし、目的とするDNA断片の増幅が難航している。これは類似の塩基配列が高度に反復されているためと考えられ、現在PCRの条件を検討中である。
4: 遅れている
(1) 標的組換えの対象と想定しているゲノム領域が約100 kbと非常に長大であり、従来の標的組換え手法が適用できないことが明らかとなった。(2) 変異導入に用いるベクターの構築ではsnoRNA遺伝子クラスターをクローニングしその部分断片を得る必要があるが、高度な反復配列を含むため、標的とする配列領域をPCRにより正確に増幅することが困難であった。
(1) 計画していた技術では、100 kb程度のゲノム領域を一括して標的組換えすることは困難と思われた。そのため、ターゲティングベクターを標的領域の上流側用および下流側用の2つに分割し、それらを順次ES細胞へ導入することにより標的組換え細胞を確実に得ることを目指した実験を実施している。(2) 変異導入に用いるためにsnoRNA遺伝子クラスターの部分断片を得る必要があるが、PCRでは期待された断片を増幅することが不可能であった。そこで、超音波やエンドヌクレアーゼを用いたランダムな切断により種々の部分断片を作成し、それらの中から目的に適した断片を選別する実験を計画中である。
すべて 2014 2013
すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (14件)
PLoS One
巻: 9 ページ: e88549
10.1371/journal.pone.0088549
RNA
巻: 20 ページ: 392-405
doi: 10.1261/rna.041202.113
