| 研究課題/領域番号 |
24659598
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
佐藤 直樹 北海道大学, 大学病院, 准教授 (70205946)
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| 研究分担者 |
尾崎 倫孝 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (80256510)
芳賀 早苗 北海道大学, 保健科学研究院, 研究員 (60706505)
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| キーワード | 光プローブ / 小胞体ストレス / 細胞死 / pH / 生体イメージング |
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| 研究概要 |
１）生体レベルで肝へのストレス評価を種々のストレス・マーカーに対する分子機能プローブを作製した。i) 酸化的ストレスを示す発光プローブとして、レドックスに感受性のあるGFPプローブを作製し、さらにルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを修飾するにより発光プローブの開発を試みた。ii) 小胞体ストレスにたいするプローブ（CHOPあるいはPERKに対する発光による機能プローブ）の作製を行い、CHOPプローブは満足できるプローブが完成したが、PERKプローブに関してはin vitroでの使用に限られた。iii) 細胞死を示す新たなプローブの作製に成功した。ネクロプトーシスに関連するRIP1/RIP3の結合に応答する光プローブを作製し、細胞レベルで機能することを確認した。iv)生存能を示すプローブ（リン酸化Aktに対する光プローブ）の作製を試みた。v)pH感受性プローブを示すプローブ（pHに依存してコンフォメーション変化を起こす分子に対して、ルシフェラーゼ再構成法を応用して作製することに成功した。
２）細胞実験：細胞ストレス実験による上記プローブの機能の特異性およびシグナル強度の検証により、in vivo使用のためのスクリーニングを行った。①上記のプローブ作製後、マウス非腫瘍性肝細胞株（AML12細胞）をもちいて、プラスミドによりtransient transfectionにより細胞内に導入して、あるいは安定導入株を作製して、光プローブの有効性を確認した。生体レベルでは、刺激によりベースラインのシグナル強度の５－１０倍のシグナルを発する必要があり、細胞レベルでの検討により、必要に応じてプローブのデザインを評価・再検討した。
３）小動物実験：GFPプローブ、pH感受性プローブに関しては、マウス肝におけるイメージングに成功した。
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