| 研究課題/領域番号 |
24659755
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| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
井上 馨 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (80133718)
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| 研究分担者 |
藤川 恵子 北海道大学, 保健科学研究院, 客員研究員 (70374246)
相原 一 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (80222462)
朝岡 亮 東京大学, 医学部附属病院, 講師 (00362202)
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| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| キーワード | 緑内障 |
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| 研究概要 |
本年度は、その欠失によって高眼圧マウスモデルを自然発症するシグナル分子Vavと会合する分子を検討することによって、眼圧上昇の分子メカニズムの解明に近づくため、Yeast Hybrid System（イーストハイブリドシステム）によるVav分子への相互作用分子のスクリーニングと、マイクロアレイ法などによるVav分子の欠失により動く分子を検索することによる、眼圧上昇にどのシグナル経路が関わっているかを検討することがおもな研究課題であった。
① イーストツーハイブリドシステムの構築について：
cDNAライブラリーをC57BL/6J正常マウスの眼球組織（隅角部）より作成した。それに、以前作成したVav3分子とVav2分子のcDNA部分をサブクローニングして作成したバイトプラスミドを使用してパイロットスタディを行った。その結果Vav2,Vav3ともに非特異的な反応が強すぎるため、スクリーニングの系として使えないことが判明した。そこで、使用するバイトコンストラクトを非特異的にならないように変更して作成中である。また、イーストシステムもより新しいものが出てきているため、そちらの使用も検討中である。
② 関わるシグナル経路の検討
正常マウス（C57BL/6J）とVav2/3KOマウスからそれぞれ眼組織の隅角部分を取り出し、RNAを抽出して逆転写酵素により組織特異的なcDNAライブラリーを作成した。この二つのライブラリーを比較して動いている分子群を判定するのだが、現在はパイロットスタディが終わった段階であり、実験は進行中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ノックアウトマウスの遺伝子型の決定は本研究には必須であり、従来はラジオアイソトープを用いる方法で行ってきた。しかし、今回は他機関との共同研究であるため、PCR法による遺伝子型決定が求められた。Vav２，Vav３遺伝子は複雑な構造を持っており、通常の方法でのジェノタイピングが困難であることが判明し、新しい方法を開発することになった。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後はノックアウトマウスの表現型、特に眼圧が高いことを確認しながら、遺伝子型を決定しながら、Vavと相互作用を行う分子を検索していく。そのため眼圧測定装置を購入して各週齡ごとに眼圧が高いことを確認して、組織採取を行い、組織切片を作成する。同時に高眼圧マウスのライブラリーを作成する。
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| 次年度の研究費の使用計画 |
該当なし
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