ＤＮＡオリガミを用いた新規免疫アジュバントの開発

2012 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 24659836
• 研究機関: 新潟大学
• 研究代表者: 寺尾 豊 新潟大学, 医歯学系, 教授 (50397717)
• 研究分担者: 川端 重忠 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 教授 (50273694) ; 中田 匡宣 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 准教授 (90444497) ; 住友 倫子 大阪大学, 歯学研究科(研究院), 助教 (50423421)
• 研究期間 (年度): 2012-04-01 – 2014-03-31
• キーワード: DNAオリガミ / アジュバント / ワクチン

研究概要

申請計画に従い，計画初年度はワクチンのアジュバント活性を向上させる可能性のあるDNA配列を外界に露出させたDNAオリガミ体を復習種類構築することを目指した．
はじめに，一本鎖DNAであるM13mp18を購入し，内在する１カ所のヘアピンループ（20 nt）を含む73 ntの領域をBsrBIで消化し，この操作で得られた7,176 ntのDNAを鋳型鎖にすることで，鋳型DNAの内部構造に左右されないDNAオリガミをパーソナルコンピュータおよび専用ソフトウエアを用いてデザインした．続いて，二本鎖DNAを理論上平面構造を保持させるために，16もしくは32塩基のオリゴヌクレオチドを鋳型と相補的にデザインした．約7,000 ntの鋳型DNAに対し，約200本の短鎖オリゴヌクレオチドの「留め金鎖」を決定することが出来た．
次に，鋳型M13mp18 DNAと留め金DNAの混合比を検討し（質量比で1:1～1:1,000），両者を混合し，95℃に加熱後，20℃まで2時間～24時間かけて緩やかに冷却し（この課程を実施するために専用のサーマルサイクラーを購入した），得られた反応DNA 鎖を原子間力顕微鏡で観察した．そして，至適の混合比と冷却時間を決定した．
現在までに，上記の工程を５回以上繰り返し，最終的にアジュバント活性誘導配列を外界に露出させたDNAオリガミ体を３形態構築し，細胞実験やマウス動物実験モデルに供するための大量合成に取り組んでいる．

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究計画で提唱した仮説を裏付けるような，M13DNAを鋳型とし，36-merのDNAオリゴ体200種類で7000ntのDNAを任意に折り畳むことができた．さらに，アジュバント効果を有すると推定する平面デザイン通のDNAオリガミ体を三種類構築できたことから，おおむね当初の計画通りに進展していると考える．

今後の研究の推進方策

(1)前年度に選出したDNAオリガミ体を市販の23価肺炎球菌ワクチン（ニューモバックス）と混合する．各種の混合比で調整した「ワクチン＝DNAオリガミ液」を準備し，マウス後脚に接種する．隔週ごとに採血を行い，肺炎球菌に対する抗体価の上昇をELISA法で測定する（寺尾・中田）．(2)抗体価の上昇を確認した後，マウスから脾臓細胞を摘出し，標的細胞株p815に対する細胞傷害性T細胞活性を測定する（川端・住友）．(3)抗肺炎球菌の抗体価が上昇した血清を肺胞上皮細胞株の培養上清に添加し，肺炎球菌の上皮細胞侵入に対する阻害能を検索する（川端・住友）．また，同抗血清を用いて，23価の肺炎球菌に対する抗体価の上昇パターンをWestern blot法で解析する（寺尾・中田）．(4)免疫増強を確認できるDNAオリガミが決定できれば，致死量の肺炎球菌をマウス口腔から感染させる．そして，経日的にマウスの生存数を記録し，感染防御効果を算出する．死亡したマウス、および30日以上生存したマウスから，肺・脾臓・腎臓・肝臓・心臓を摘出し，滅菌した磨砕装置で各組織をPBSと混和する．混和液を血液寒天培地へ接種し，翌日に生育した菌数を算定する．そして，各臓器へ伝播した肺炎球菌の数を組織重量比で算出する（寺尾・中田）．
(5)最後に，懸念される副反応である抗DNA抗体の産生量を測定する．手順(1)で採取したマウス血液と抗DNA抗体価測定用のELISAキットで定量する（川端・住友）．
得られた結果は，研究代表者自身が学会および学術誌で専門家を対象に報告する．そして，申請者が作成する研究室のホームページから，リアルタイムで広く国民に発信する（http://web.dent.osaka-u.ac.jp/~mcrbio/）（寺尾）．

次年度の研究費の使用計画

動物実験を実施予定であるため，実験動物費を申請する（ディスポーザブル飼育ケージ代も含む）．実験機器は購入せず，動物実験で得られた試料を解析するための試薬およびプラスチック器具を購入する計画である．また，最終的な実験成果を発表するために，国内および国際学会への参加旅費を計上する．そして，全研究成果を英文の学術雑誌へ投稿するために，英語論文の英文校正費と校正者との通信連絡費，および印刷費を計上する．

研究成果

• [雑誌論文] Cysteine proteinase from Streptococcus pyogenes enables to evade innate immunity via degradation of complement factors. (2013)
  • 著者名/発表者名: Honda-Ogawa, M., Ogawa, T., Terao, Y.*, Sumitomo, T., Nakata, M., Ikebe, K., Maeda, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 15854-15864
  • 査読あり
• [雑誌論文] Group A streptococcal cysteine protease cleaves epithelial junctions and contributes to bacterial translocation. (2013)
  • 著者名/発表者名: Sumitomo, T., Nakata, M., Higashino, M., Terao, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 288 ページ: 13317-13324
  • 査読あり
• [雑誌論文] Hydrogen peroxide produced by oral streptococci induces macrophage cell death. (2013)
  • 著者名/発表者名: Okahashi, N., Nakata, M., Sumitomo, T., Terao, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: PLoS one 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] Neonatal pleural empyema caused by emm type 6 group A Streptococcus. (2013)
  • 著者名/発表者名: Nohara, F., Nagaya, K., Asai, H., Tsuchida, E., Okamoto, T., Hayashi, T., Sakata, H., Terao, Y., and Azuma, H.
  • 雑誌名: Pediatirics International 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] The virulence factors and pathogenic mechanisms on Streptococcus pyogenes. (2013)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi, M., Terao, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: Cell. Microbiology 巻: in press ページ: in press
  • 査読あり
• [雑誌論文] MicroRNA fragments derived from Streptococcus pyogenes enable activation of neutrophil phagocytosis: in vitro study. (2013)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., Terao, Y., Honda-Ogawa, M., Hashimoto, S., Ikebe, K., Maeda, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: Microb. Infect. 巻: 15 ページ: 212-218
  • 査読あり
• [雑誌論文] Group A streptococcus adheres to pharyngeal epithelial cells with salivary proline-rich proteins via GrpE chaperone protein. (2012)
  • 著者名/発表者名: Murakami, J., Terao, Y., Morisaki, I., Hamada, S., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 287 ページ: 22266-22275
  • 査読あり
• [雑誌論文] α-enolase of Streptococcus pneumoniae induces formation of neutrophil extracellular traps. (2012)
  • 著者名/発表者名: Mori, Y., Yamaguchi, M., Terao, Y., Hamada, S., Ooshima, T., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Biol. Chem. 巻: 287 ページ: 10472-10481
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long-term survival of salivary streptococci on dental devices made of EVA. (2012)
  • 著者名/発表者名: Ogawa, T., Yamasaki, S., Honda, M., Terao, Y., Kawabata, S., and Maeda, Y.
  • 雑誌名: Int. J. Oral Science 巻: 4 ページ: 14-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] Involvement of T6 pili in biofilm formation by serotype M6 Streptococcus pyogenes. (2012)
  • 著者名/発表者名: Kimura, K. R., Nakata, M., Sumitomo, T., Kreikemeyer, B., Podbielski, A., Terao, Y., and Kawabata, S.
  • 雑誌名: J. Bacteriol. 巻: 194 ページ: 804-812
  • 査読あり
• [雑誌論文] S-carboxymethylcysteine inhibits adherence of Streptococcus pneumoniae to human alveolar epithelial cells. (2012)
  • 著者名/発表者名: Sumitomo, T., Nakata, M., Yamaguchi, M., Terao, Y., and Kawabata S.
  • 雑誌名: J. Med. Microbiol. 巻: 61 ページ: 101-108
  • 査読あり
• [学会発表] Moleculara mechanisms of complement evasion by Streptococcus pyogenes cysteine protease SpeB (2013)
  • 著者名/発表者名: 本多真理子,寺尾豊,住友倫子,中田匡宣,川端重忠
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Group A streptococcal cysteine proteases, SpeB and Sib35, cleave epithelial junctions (2013)
  • 著者名/発表者名: Tomoko Sumitomo, Miharu Higashino, Akari Kominami, Masanobu Nakata, Yutaka Terao, and Shigetada Kawabata
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Cell wall anchoring mechanism of FCT region type 3 pili in Streptococcus pyogenes (2013)
  • 著者名/発表者名: Masanobu Nakata, Tomoko Sumitomo, Yutaka Terao, Shigeyuki Hamada, and Shigetada Kawabata
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Streptococcus sanguinis induces foam cell formation and cell death of macrophages (2013)
  • 著者名/発表者名: N. Okahashi, T. Okinaga, A. Sakurai, Y. Terao, M. Nakata, S. Kawabata, T. Nishihara
  • 学会等名: 第86回日本細菌学会総会
  • 発表場所: 千葉市
  • 年月日: 20130318-20
• [学会発表] Streptococcus pyogenesのシステインプロテアーゼSpeBによる補体免疫回避機構の解析
  • 著者名/発表者名: 本多 真理子，橋本 栄，寺尾 豊，川端 重忠
  • 学会等名: 第21回Lancefieldレンサ球菌研究会
  • 発表場所: 吹田市
• [学会発表] T6線毛のバイオフィルム形成と菌体凝集への関与
  • 著者名/発表者名: 森田 知里，中田 匡宣，木村 敬次Richard，住友 倫子，寺尾 豊，川端 重忠
  • 学会等名: 第21回Lancefieldレンサ球菌研究会
  • 発表場所: 吹田市
• [学会発表] Streptococcus pyogenesのシステインプロテアーゼSpeBが補体免疫機構に及ぼす影響
  • 著者名/発表者名: 本多 真理子，寺尾 豊，川端 重忠
  • 学会等名: 第65回日本細菌学会関西支部総会
  • 発表場所: 神戸市
• [学会発表] ヒト補体免疫系回避機構におけるStreptococcus pyogenes 分泌型プロテアーゼSpeBの機能解析
  • 著者名/発表者名: 本多 真理子，寺尾 豊，住友 倫子，中田 匡宣，川端 重忠
  • 学会等名: 第5回口腔環境制御」カテゴリー集会
  • 発表場所: 長崎市
• [図書] 化学療法の領域（レンサ球菌感染症の予防・治療法の確立に向けた展望） (2013)
  • 著者名/発表者名: 寺尾 豊
  • 総ページ数: in press
  • 出版者: 株式会社医薬ジャーナル社
• [備考] 新潟大学大学院医歯学総合研究科微生物感染症学分野
  • URL: http://www.dent.niigata-u.ac.jp/microbio/microbio.html
• [備考] 微生物DNAのナノスケール解析
  • URL: http://www.niigata-univ-mid.net/study/index2.html
• [備考] アウトリーチ活動の案内
  • URL: http://www.niigata-univ-mid.net/about_us/index.html
• [備考] 研究内容とアウトリーチ活動の問合せ
  • URL: http://www.niigata-univ-mid.net/contact/index.html