| 研究課題/領域番号 |
24659872
|
|---|
| 研究種目 |
挑戦的萌芽研究
|
| 研究機関 | 新潟大学 |
|---|
研究代表者 |
川瀬 知之 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (90191999)
|
|---|
| 研究分担者 |
奥田 一博 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00169228)
永田 昌毅 新潟大学, 医歯学総合病院, 講師 (10242439)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2012-04-01 – 2014-03-31
|
| キーワード | 歯槽骨 / 骨膜細胞 / 培養 / 軟骨誘導 / 分化 |
|---|
| 研究概要 |
軟骨誘導の初期操作は以下に記述するプロトコールにしたがって実施した。まず、同意のもとに提供いただいたヒト歯槽骨由来の骨膜片を10% FBSを含むMedium 199培地か幹細胞用培地(MesenPRO)で組織片培養して、ある程度の大きさ(直径30mm以上)になるまで骨膜シートとして成長させた。その後、スクレーパーを用いて傷害が最小になるように丁寧に剥離し、サンプルチューブに移した。遠心することによって、骨膜シートを折りたたまれたような球状の形態に成形した。この操作によって、シート内で多層化している細胞はより高密度な状態になる。この状態で、TGFβ等を含む軟骨誘導培地に交換し、旋回培養器で培養を続けた。
一定期間培養して得られた球状の骨膜細胞塊について、組織学的あるいは分子生物学的解析を行なった。組織学的には、Alucian blueやToluidine blueで濃染するproteoglycansの豊富な産生と蓄積が認められた。さらに、免疫組織染色によって、軟骨細胞のマーカーであるcollagen type II, aggrecan, Sox9などの発現を認めた。一方、骨芽細胞のマーカーであるcollagen type Iは細胞塊の外表面に一層局在が確認された。またRunx2はSox9陽性細胞と重なるように局在していることが判明した。
同様の傾向が、発現しているmRNAの網羅的解析によっても確認された。現在、さらに詳細に解析を行なっているところである。
以上の結果から、骨膜シートを球状にして分化誘導培地のなかで回転させながら培養するというコンセプトは十分実用に耐えるものと判断した。一方課題としては、直径が5mm以上の大きさにならないことから、旋回培養の初期段階ではMedium 199などの増殖培地を引き続き使用した方がいいのかもしれない。この点は早々に結論を出したい。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
軟骨内骨化しないといわれる歯槽骨の骨膜から得た細胞をECMが豊富に含まれた状態で高密度培養すると軟骨細胞様に分化することが示された意義は大きい。また、当初はバイオリアクターとしてスピンナーフラスコを使用したが、低速回転においても細胞が受ける損傷が大きいことから、旋回培養器に代えたことは有意義であった。現在、当初の計画に従って、mRNA発現の解析と動物実験を継続しているところである。
|
| 今後の研究の推進方策 |
本年度は不首尾に終わったが、軟骨分化のキーとなる細胞内情報伝達系であるβ-cateninの阻害剤による有効な処理法を考案したい。動物実験の結果を受けて、再度組織工学的軟骨分化誘導法を改良する必要があるだろう。大きさを確保するためには、部分的にスキャホールドを使用することも有意義かもしれない。
|
| 次年度の研究費の使用計画 |
試薬と実験動物を主体とする消耗品購入のための物品費と研究成果の発表ならびに最新情報収集のための学会出張のための旅費に使用する計画である。
|
